聚乙二醇接枝壳聚糖聚离子胶束的制备与体外表征研究

Chinee Journal of New Druge 2007, Vol. 16 No. 13中国新药杂志2007年第16卷第13期聚乙二醇接枝壳聚糖聚离子胶束的制备与体外表征研究杨可伟,李馨儒,杨卓理,刘艳(北京大学药学院药剂学系，北京100083)[摘妻] 目的:制备载有甘草酸二铵(DG)的聚乙二醇接枝壳聚糖(mPEG-CS)聚离子胶束,考察胶束的理化性质及体外释放机制。方法:通过壳聚糖烷基化合成mPEG-CS,以三聚磷酸钠为引发剂,利用静电相互作用制备载有DC的mPEG-CS聚离子胶束。考察胶束的形态、粒径和zeta电位。用透析袋法研究载药胶束在不同介质中的释放动力学。结果:制得胶束的平均粒径为(38.2+0.9)nm;包封率为(97.6+0.7)%;胶柬的稳定性良好;胶束的释放与释放介质的种类、pH值和浓度有关。结论:mPEC-CS是一种良好的制备聚离子胶束的高分子材料,聚离子胶東是离子型药物的良好载体。[关键词] 聚离子胶柬;壳聚糖;甘草酸二铵;体外释放[中图分类号] R943. 42;R975. 5[文献标识码] A[文章编号] 1003 - 3734(2007)13- 1030 -05Diammonium glycyrrhizinate loaded methoxy PEG-grafted-chitosanpolyion complex micelles: preparation and in vitro characterizationYANG Ke-wei ,LI Xin-ru, YANG Zhuo-li,LIU Yan( Department of Pharmaceutics ,School of Pharmaceuical Sciences ,Peking University ,Bejing 100083 ,China)[Abstract] Objectives: To prepare and characterize the diammonium glyeyrhizinate loaded me-thoxy poly( ethylene glycol ) -grafted-chitosan polyion complex micelles ( mPEG-chitosan PIC micelles).Methods: mPEG-chitosan was synthesized by alkylation of chitosan with mPEG-aldehyde. mPEG -chi-tosan PIC micelles were prepared using sodium tripolyphosphate as an initiator via the electrostatic inter-action. The micelles were observed under the transmission electron microscopy (TEM). Mean size andzeta potential values of the micelles were measured using a zetasizer based on the dynamic light scatter-ing. In vitro release of the diammonium glyrrhizinate-loaded mPEG-chitosan PIC micelles was measuredusing a dialysis method in various buffered solutions. Results : Diammonium glyeyrrhizinate-loadedmPEC-chitosan PIC micelles were successfully prepared with an average diameter of (38.2 +0. 9) nm.Encapsulation eficiency of diammonium glyeyrrhizinate was(97.6 +0.7)%. The micelles were stable atroom temperature for 1 month , and the release rate was dependent on the anionie patterns, pH values and[作者简介]吕庆淮(1962-),男,副教授,主要从事精细化[4] KOICHI Y, KIYOSHI T. Proces for producing opicallyl necive学品的合成工作。联系电话:(0539) 2060183 - 800, E-mail:benzene- sulonanide derivatives:EP , 0380144 [P]. 1990 -08 -01.becyis@ 163. com。[5] OFOSU-ASANTE K, STOCK LM. A eletire method for deute-rium exchange in hydroaromatic compounde [J]. J 0rg Chem,[参考文献]1986, 51(26) :5452 - 5454.6] DAENIKER HU, GROB CA.3-quinuclidone hydrochloride[J].[1] 胡凯， 丁鼎东.帕浴诺司琼市场前景看好[J].上海医药，0rg Synh, 1964, 44:86 -90.2004 ,25(11) :518.[7] CLARK RD, MILLER AB, BERCERJ, u al. 2-( quinuclidin-2] JACOB B, CLARK ROBIN D, ECLEN RICHARD M,et al. Ti3-yI) pyrido[4,3-b] indol-I -ones and isoquinolin -ones potentecyclie 5-HT, receptor antgonists:Us, 5202333 [P]. 199 -04 -13.anlgoniste [J]. J[3] LANCIOIS M, MEYER C, SOULER J L. Synthesis of( R) and中国煤化工”(S)-3-aminoquinuclidine from 3-quinuclidinone and ( S) and(R)-1 -phenethyl. amine [J]. Synth Commun, 1992, 22(13):YHCNMHG编辑:王宇梅/接受日期:2006-07-101895 - 1911.一1030--Chinee Joural of New Druge 2007 Vol. 16 No. 13中国新药杂志2007年第16卷第13期concentrations of the release media. Conclusion : mPEG-chitosan PIC micelles could be used as a poly-mer carrier suitable for encapsulation of anionic drugs.[Key words] polyion complex micelles ;chitosan ;diammonium glyrhizinate; in viro release近20年来,具有核壳结构的大分子胶束由于材料与方法具有高效、长效、安全等特点受到广泛关注,已经成为药剂学领域的一个研究热点"。最初,大分子胶1试药与仪器束主要由两亲性嵌段共聚物形成,聚合物的疏水嵌傅立叶变换红外光谱仪AVATAR360(美国段在水中通过疏水相互作用构成胶束的内核,而亲.NICOLET) ;纳米粒度仪( Malvem Zelasizer , nano se-水嵌段则在胶束内核的周围构成胶束的外壳,用于ries. ,ZEN3500 ,UK) ;Hitachi . - 500 型透射电子显微镜增溶疏水性药物。除了疏水相互作用外,聚离子聚(日本HITACHI公司) ;6010型紫外可见分光光度计合物与带相反电荷的物质之间的静电相互作用也可(惠普上海分析仪器厂);台式离心机TGL- 16C(上作为形成胶束疏水内核的驱动力,由此形成一种新海安亭科学仪器厂); MSL2300型核磁共振仪(德国型胶束-聚离子复合物胶束( polyion complex mielle,Bruker) ;LC- 10AT高效液相色谱仪(SPD - 10A紫PIC micelle)。利用PIC胶束,已经成功包载蛋白质外检测器,日本SHIMADZU公司),透析袋(膜截留相类[2]核酸类[3-7]等药物。PIC 胶束具备传统聚合对分子质量3500 ,美国spectrum)。物胶束的特点:结构稳定;粒径小且粒径分布窄;体DG(99%，北京天衡药物研究所,批号:内循环时间长;安全性好;具有靶向性(6.8-10);制备20050520) ;聚乙二醇单甲醚( methoxy poly ( ethylene简单,易于贮存等。此外,PIC胶束还具有其独特优glycol) ,mPEG , Mn =2000, Fluka);CS(相对分子质势:载药范围广泛;载药过程基本在水溶液中进行,量10000,青岛思特科技有限公司);三甲基苯磺酸.避免有机溶剂的使用,可以消除溶剂残留引发的毒(Tr-nitro benzene sulfonate ,TNBS ,Sigma) ;氰基硼氬化钠( NaBH,CN , Sigma) ;TPP(徐州天富化工有限公副作用等。壳聚糖( chitosan ,CS)是甲壳索脱乙酰化的产物，司) ;其他试剂均为分析纯。化学名为(1,4)-2-氨基-2-脱氧-B_D-葡聚糖,是自然2 mPEG-CS的合成与表征界中惟一的碱性多糖,是一种具有生物相容性、生物2.1mPEG的醛基化")将mPEG溶于无水可降解性及pH敏感性的阳离子聚合物。在弱酸性DMSO中,加人适量的乙酸酐,室温下搅拌8h。然介质中,壳聚糖分子中的氨基质子化,使壳聚糖带正后用乙醚沉析、过滤、真空干燥。再用氯仿溶解，电,它可以与某些荷负电的物质通过静电相互作用发乙醚沉析,过滤后真空干燥,重复3次。得到醛基化的mPEG(mPEG-CH0)。产物用红外光谱进行生聚集,故可以作为PIC胶束的聚阳离子链段。检测。聚乙二醇( poly( ethylene glycol), PEG)是形成2.2 mPEG-CS 的合成"与表征将CS溶于pH胶束应用最为广泛的亲水嵌段。极强的水化作用及4.9的醋酸盐缓冲液中，按mPEG-CHO与CS单体高度的构象柔韧性使PEG在胶束外侧形成一层致的物质的量比1:10加入mPEG-CH0,室温下振荡密的水化“壳" ,使胶束具有空间稳定性。同时PEC24h后,加入NaBH,CN,再于室温下振荡48h。然链的柔顺性使其长链来回摆动,分子构象来回变动,后将反应液移人透析袋内,用蒸馏水透析72 h,透析模糊了免疫系统的识别和吞噬,使胶束具有了隐形液过滤后冷冻干燥。冻干粉用丙酮抽提除去未反应的能力。亲水嵌段的这些性质可延长胶束在体内的的mPEG-CHO,即得到mPEG-CS。聚合产物用'H-循环时间,避免被网状内皮系统吞噬,并且末端具有NMR进行检测。采用TNBS法["3)测定mPEC-CS的功能基团的PEG为胶束的靶向性提供了可能[6.9]。接枝率。本实验合成了PEG接枝壳聚糖( mPEG-CS),以2.3 mPEG-CS 的pH敏感度测定将mPEC-CS甘草酸二铵( diammonium glyrrhizinate, DG)为模分散中国煤化工乙酸溶液,用pH型药物,用三聚磷酸钠(TPP)作聚集引发剂,制备载计监0HCNMHGnm处监测该过程有DG的PIC胶束,并考察了其物理化学性质和体中吸收皮的变化，佣正mrro-us在水中溶解的pH外释放的机制。值范围。.一1031一Chinese Jourmal of New Druge 2007 ,Vol.16 No. 13中国新药杂志2007年第16卷第13期3PIC胶束的制备及包封率的测定0H末端羟基氧化为醛基。将mPEG-CS溶于pH 3.5的醋酸盐缓冲液中，用氢谱验证了聚合物mPEG-CS的结构。结果如与DG溶液混合后,在搅拌下向其中滴人适量的下, HNMR(D20,含10% DCI,300 MHz):8 5.12 ~TPP溶液,即得PIC胶束。5.38(H-1,H-1'),3.81(H-3, H4, H-6') ,3.67(H5,将制备的PIC胶束溶液用截留相对分子质量为H6),3. 52(-0CH2),3.25(-0CH,),3.09(H-2),3000的超滤管进行超滤,用HPLC法测定滤液中DG2.09(NHAc),与文献[14,15]相符,证明已将mPEG的浓度。色谱条件:DiamondODSCrg色谱柱(150接枝到CS.上。按TNBS法测定的接枝率为9.89%。mmx4.6 mm,5 μm) ,流动相:甲醇-5%冰醋酸水溶CS为碱性多糖,一般在低pH值下易溶,在高液(82:18),检测波长:252nm,流速:1.0mL.min-1pH值下难溶。为了评价mPEG-CS的溶解性与pH柱温:30 C。按照如下公式计算包封率:包封值的关系,在 420 nm波长处对不同pH值下溶液的率/%=(投药量-滤液中DG浓度x超滤前胶束溶透光率进行了考察。将mPEG-CS直接分散在蒸馏液体积)/投药量x 100。水中,得混浊液体,随着乙酸溶液的加入,体系的pH4胶束的形态及粒径考察.值逐渐下降,体系慢慢变澄清,透光率值也逐渐增用动态光散射( Dynamic light scattering, DLS)法大。当pH<5.58时溶液完全澄清,透光率值趋于测定胶柬的粒径及粒径分布(Plydispersityindex，稳定。因此mPEG-CS在pH<5.58的水溶液中可PDI) ,用纳米粒度仪测胶束zeta电位。以磷钼酸负以完全溶解,在pH >5.58的水溶液中部分溶解,所染法制备胶束样品,于透射电镜( Transmission elec-以在制备胶束时应注意控制溶液的pH值。tron microscopy ,TEM)下观察胶束的形态。2PIC胶束的形态与粒径5药物在胶束中的位置考察.图1为胶束的透射电镜照片。图1A清晰地显将胶束溶液超滤后,冷冻干燥,用KBr压片法示出胶東呈球形,粒子大小均匀,计算得到的平均粒进行红外光谱的测定,并同时记录DG的红外光谱,径为(21.6 +4.8)nm(n= 100)。由图2B清晰可考察药物在胶束中的位置。见,在胶束的内核外有一冠状层,该图清晰地显示出6胶束的初步稳定性考察胶束的核壳型结构。将新鲜制备的胶束溶液密封于西林瓶中,置于60 C的恒温箱中,于0,2 ,4,7,14d分别取样测量粒径。同时将新鲜制备的胶束溶液超滤,除去游离的药物后,密封于西林瓶中,于室温下放置1个月,测量粒径变化,同时超滤胶束溶液,用HPLC法测定滤液中药物的含量,考察胶束中药物的泄露情况。A放大5x10*倍B放大1x10*倍7体外释放试验图1 甘草酸二铵的PIC胶束的透射电镜图取1 mL胶束溶液装入透析袋内,置于30 mL,DLS法测得胶束的粒径为(38.2 +0.9) nm。比37 C的释放介质中,搅拌,分别于0.25 ,0.5,0.75，TEM 法测得的粒径要大,原因是DLS方法中胶束粒1,1.5,2,3,4,6,8,12,20h定时取出释放介质3.0子处于“湿"状态,胶束表面的PEC链溶剂化,呈舒mL,同时补充相同体积的新鲜释放介质。用HPLC展状态,胶束的粒径相对较大;而进行TEM测定时,法测定释放介质中的药物含量,绘制释放曲线。并胶束粒子处于“干燥”状态,胶束表面的PEG链呈卷分别考察胶束在不同释放介质、不同pH值的缓冲缩状,故胶束的粒径相对较小。液和不同浓度的磷酸盐缓冲液(PBS)中的释放动力3药物在胶束中的位置学,以探究PIC胶束的药物释放规律。图2为胶束冻干粉和DG的红外光谱图。形成胶束后,DG在1717cm:'处的羰基峰消失,而出结果与讨论现1577 cm~'的大峰,表明DG的羰基与CS的氨基1 mPEG-CS的表征发生热中你用北亦了甘光学性质,这与文献mPEG-CHO的傅立叶变换红外光谱与mPEG- [16中国煤化工包封在胶東内核。0H的谱图相比,在1 738 cm~'处出现醛基特征峰，采CN M H G为(97.6+0.7)%其他峰位置与mPEC-0H一致,证明已经将mPEG- (n=4)。-一 1032一Chinee Jourmal of New Drugs 2007,Vol. 16 No. 13中国新药杂志200年第16卷第13期根据胶束在不同释放介质中的释放行为,可以1717,推测DG-PIC胶束的释放机制可能为由离子交换诱s 1600se导的溶胀和扩散。由于胶束的内核带正电,在核壳的界面区域可吸附一定量的甘草酸负离子。在释放15773500 3000 2500 2000 1500 1000 500初期,首先是吸附在界面区域的药物与释放介质中的阴离子发生交换,产生突释现象。随后胶束内核图2 DG原料(A)和DC-PIC胶束(B)的红外光谱图中的甘草酸负离子和三聚磷酸根负离子与溶液中的4胶束的初步稳定性图3为60C放置过程中胶束的粒径和多分散阴离子逐渐发生交换，导致胶東内核的离子相互作性的变化情况。结果表明,在60下7d之内,胶用减弱,释放介质慢慢滲透进人内核,使胶束溶胀，束的粒径和多分散性指数(PDI)只有微小变化,说又进一步加速内核的离子交换,如此相互作用,最终明胶束的结构至少可以在7 d内保持稳定。14d 时使药物完全释放出来。对于胶束在纯水中的释放，粒子的粒径明显增大,PDI也相应增大,说明胶束间由于没有可供交换的离子,所以仅有核壳界面区域发生了聚集。而在室温下,即使放置1个月,胶束的吸附的部分药物缓慢释放到水中。另外,与等浓度的粒径只发生微小变化(由38 nm变为41 nm)。由此氯离子相比，磷酸根离子所带电荷更多,离子交换能可见,此类胶束对热不稳定,应避免在高温下贮存。力更强,所以在PBS中药物的释放更快。胶束zreta电位随药物释放的变化进一步 证明DC-PIC胶東药物的释放主要由离子交换控制。■粒轻9+ PDI5.2 释放介质的pH值对释放行为的影响 图5为载药PIC胶束在等浓度(50 mmol.L")不同pH值的释放介质中的释放曲线。经过20 h,胶東在pH4.0的PBS中释放63%,在pH 7.4的PBS中释放图360心时胶束溶液的粒径和PDI随时间的变化曲线91% ,在pH9.0的PBS中释放97%。随着释放介胶束室温放置1个月后,仅有0.05%的药物泄质pH值的升高,药物释放加快。这可能与CS的结漏,表明药物在室温条件下可以稳定存在于胶束内构特点有关。CS 的pKa为6.5,其荷电情况与溶液核中。载药胶束的长期稳定性正在进- -步的实验研的pH值有关。Shu等”计算出不同pH值时CS的究中。带电状态。在酸性溶液中CS带正电荷较多，随着5体外释放pH值升高,氨基逐渐脱质子化,单位链长的CS所5.1 释放介质种类对释放行为的影响 图4为载带正电荷数减少。同样在本研究中,释放介质的pH药胶束在不同释放介质中的释放曲线。由图4可知，值越高,PEG接枝的CS脱质子化的程度也越大,使在蒸馏水中药物释放极其缓慢,20 h仅释放6. 7% ;在CS链上的正电荷数减少,与甘草酸负离子和三聚磷生理氯化钠溶液中,20 h药物释放72. 2%;在与生理酸根负离子的相互作用减弱,导致药物释放加速。氯化钠溶液同浓度(154 mmol.L-")的pH 7.4的✧PBs(H9.0)30 to PBS(pH7.4)PBS中药物释放最快,20h释放93. 5%。粒径测量、凸 PBS(H4.0)需酸盐圾冲液(PH4.)结果显示,胶束在纯水中释放前后的粒径和zeta电位均只发生微小变化。而在PBS中释放20h后胶束粒径由最初的45nm增大到300nm,zeta电位由最初的40mV下降到0。1416182022图S胶東在不同 pH的释放介质(50 mmolL1)t女DG綹缠在PBS中的释放作对照中释放曲线(n=3)去PH 7.,4的154 mmolrL'PBS生理氯化的落诫此外,从图5中还可以看出,即使同是pH4.0也盛饰水的释中国煤化工中液中的释放比在PBCN M H G的药物释放受释放101214181820介质中阴离于性质的影响。图4不同释放介质中胶束的释放曲线(n=3)5.3释放介质浓度对释放行为的影响图6 为Chinese Journal of New Drygs 2007 .Vol.16 No. 13中国新药杂志2007年第16卷第13期DG-PIC胶束在不同浓度的PBS中的释放曲线。缓.4] 魏晓红,梁文权,潘远江. PEC化壳秦糖/DNA自组装复合冲液浓度越低,药物释放越慢。这是由于释放介质.物的制备、表征和体外Hela细胞转染研究[J].高等学校化学学报, 2003, 24(11) :1993 - 1996.的浓度降低,导致释放介质中的阴离子与甘草酸负[5] HARADA A. TOGAWA H, KATAOKA K. Physicochemical离子和三聚磷酸根负离子的交换变慢,于是药物释propertics and nuclease reistance of antisenseoligodeoxynucleoti-放速度减慢。des entrapped in the core of polyion complex micelleas composedof poly( ethylene gyeol) .poly( L.lygine ) bloeok copolymers[J].Eur J Pharm Sei2001, 13(1) :35 -42.心154 mol/L'PBS合50 mmol-L'PBS6] WAKEBAYASHI D, NISHIYAMA N, YAMASAKI Y, et al.女5 mmo'rL'PBSLactose-conjugated polyion complex micelles incorporating pla8-mid DNA as a targeable gene vector system: their preparationand gene transfecting eficiency against eultured HepC2 celle0246810121416182022[].J Control Release, 2004, 95(3) :653 -664.图6胶東在不同浓度PBS( pH =7.4)中的释放曲线(n=3)7] TIAN HY, DENG C, LIN H, et al. Biodegradable cationie PEG-PEI-PBLG hyerbranched bloek copolymer; synthesis and micelle结论characteization[J]. Biomatrias, 2005 .26(20) :4209 -4217.[8] Y00 HS, PARK TC. Folate receptor targeted biodegradable pol-本实验的研究结果表明,mPEC-CS是一种很好ymerie doxorubicin micelles[J]. J Control Release, 2004, 96的制备PIC胶束的高分子材料。制备的胶束可高效(2) :273 -283.包载DG,具有粒径小、稳定性好的优点。该胶東的9] YAMaMOTO Y, NACASAKI Y, KATO Y, at al. Long-circulat.释放机制为主要由离子交换诱导的溶胀和扩散,ing poly( ehylene glycol) -olyl(,1Lactie) bok copolymer mi.体外释放动力学与释放介质的种类、pH值和浓度celle with modulated surfce charge[J]. J Control Release,有关。2001, 77(1):27 -38.本实验虽然以DG为模型药物,但此类胶束的.[10] LEE ES, NA K, BAE YH. Doxonubicin loaded pH- snsitive pol-ymerie micelle for reveral of reistant MCF-7 tumor[J].J Con-载药范围可以扩展到其他一些带负电的药物,如核trol Release, 2005 ,103(2) :405 -418.酸、多肽和蛋白质类药物。用mPEG-CS制备PIC胶[11] LLANOS GR, SEFTON MV. Imobilization of Poly( ethylene gy-束可以解决壳聚糖纳米粒粒径大和稳定性差的问.col) onto a Poly( vinyl alcohol)Hydrogel. 1. Syathesis and Charac-题。因此PIC胶束有望成为一些带负电药物的优良trization[J]. Macromolecules, 1991, 24(23) :6065 -6072.载体。有关DG的mPEG-CS PIC胶束在大鼠体内的[12] 王鹏,莫秀梅,相羽诚一 ,等.甲壳胺-g-PEC的合成及医用性能的研究[J].功能高分子学报，1997, 10(3):359 -364.药动学正在研究中。[13] BERNKOP SCHNURCH A, KRAJICEK ME. Mucoadhesive pol-[作者简介]杨可伟(1982-),男,硕士研究生。 联系电yimers as platorms for peroral pepide delivery and absorption:话:(010)82801508 ,E-mail:kwyang@ bjmu. edu. cn。synthesis and evaluation of dierent ehitosan-EDTA conjugates[通讯作者]刘艳(1964-),女,副教授,主要从事新型药[].J Control Relese , 1998 ,50<2) :215 -223.物载体的研究。联系电话:(010)82801508 ,E-mi:anliu@ [14] SUcImOTO M, MORIMOrO M, SASHWA H, eal. Pepare-bjmu. edu. en。tion and characterization of water -soluble chitin and chitosan de-rivatives[J]. Cabohydrate Polymers, 1998, 36(1) :49 -s9.[参考文献][15] BHATTARAI N, RAMAY HR, CUNNJ, et al. PEC-gafted ch-itoan 8 an injectable thermosensitive hydrogel for Bustained pro-[1] KATAOKA K, HARADA A, NAGASAKI Y. Block copolymertein rlease[J]. J Control Release, 2005, 103(3) :609 - 624.micelles for drug delivery : design, characterization and biological[16] WU Y, YANG WL, WANG CC, et al. Chitosan nanparticles asaignificance[J]. Adu Drug Delie Rer ,200, 47(1);113 -131.a novel delivery sytem for smmonium glyrhizinte[J]. Int JHARADA A, KATAOKA K. Novel polyjion complex micelles明Pham ,2005 , 295<2) :235 -245.trapping enryme molecules in the core. [ I ]: Characterization[17] SHU xz, ZHU KJ. The influence of mulivalent phophate struc-of the mielle prepared at non-stoichiomelrie mixing ralios[J].ture on the properties of ionically cos-linked chitosan flms forLangmuir, 99 15(12): 4208 -4212.controlled drug release[J]. Eur J Pharm Biopharm，2002, 54KAKIZAWA Y, KATAOKA K. Block copolymer mecele for de-中国煤化工livery of gene and relaied compounds[J]. Adu Drug Deliv Rev,MHCNMHG日.200-05-10.2002, 54(2):203 -222.一1034 一