蛋白类药物聚乙二醇修饰的研究

中国煤炭工业医学杂志2008年2月第11卷第2期文章编号1007-9564(2008)02-0271-04蛋白类药物聚乙二醇修饰的研究40038重庆市,重庆大学生物工程学院旷瑜王金霞王伯初程永刚·肖中元·徐波关键词蛋白类药物;聚乙二醇;化学修悼物循环半衰期的延长。同时,PEG修饰会使蛋白活性降低,这种影响大小与修饰剂、修饰条件和蛋白本随着蛋白质化学和分子生物学的发展,用于各身的特点相关m种疾病治疗的蛋白质类药物的研制和应用已成为生PEG的末端羟基是其反应基团,若直接和蛋物医药产业发展的热点蛋白药物具有作用专一、白反应反应条件较为苛刻会导致蛋白生物活性降高效等优点。估计现在蛋白药物(糖蛋白非糖蛋白0%~35%然而蛋白低或丧失,为使蛋白能在温和条件下以较高的速率作为药物注射入生物体内时具有自身的缺点:免疫和PEG偶联,需先将PEG活化如烷基化或酰基化原性半衰期短酶解性以及低的溶解度,这些缺点等。使之转化成活泼酯醛基酰肼等严重制约了蛋白类药物的发展。解决这类问题的方3mPEG修饰蛋白的种类法主要有:①对氨基酸序列的处理以降低免疫原3.1mPEG对氨基的修饰选择氨基作为修饰位性和酶解性;②连接于免疫球蛋白或浆蛋白如清蛋点,因为氨基具有亲核性,且大多存在于蛋白的表白( Albumin);③与药物载体相结合,以起到对药物面最普遍的是赖氨酸的c-氨基和N末端氨基的保护和缓释作用;④连接天然或合成的聚合物。常用的mPEG活性酯有:①PEG二氯三嗪衍生物目前对蛋白药物进行化学修饰是研究的热点常用( Peg dichlorotriazine);②PEG三氟乙基磺酸酯修饰剂为聚乙二醇( polyethylene glycol,PEG)及其( PEG tresylate);③PEG琥珀酰亚胺碳酸酯(PEG行生物。succinimidyl carbonate);④PEG苯丙三唑碳酸酯1聚乙二醇(PEG)简介( PEG benzotriazole carbonate);⑤PEG对硝基苯碳聚乙二醇(PEG)是由环氧乙烷聚合而成,其分酸酯(PEGp- nitrophenyl carbonate)⑥PEG三氯子式为HO-(cH2CH2O)-CH2CH2-OH,PEG苯碳酸酯( PEG trichlorophenyl carbonate);⑦PEG通常呈电中性,易溶于水和许多有机溶剂如乙醇、二碳酰咪唑酯( PEG carbonylimidazole);⑧PEG琥珀甲苯丙酮等。PEG的分子量从几百到几万,选择酰亚胺琥珀酸酯( PEG succinimidyl succinate),性大用于医药的PEG分子量主要介于几百到它们与蛋白的反应如图120000之间。分子量超过1000的PEG通常无毒,但此类反应具有一定缺陷:①二醇分子的存在;是FDA批准的可用于药物,食品和化妆品的聚合②仅局限于低分子量的mPEG;③连接键不稳定④物.直接用PEG修饰时易发生交联和团现象,故副反应较多;⑤选择性差等。所以修饰结果并不理单甲氧基聚乙二醇( monomethoxy PEG,mPEG)应想。于是有人采用PEG醛来对蛋白进行修饰,例用较多,其分子式为CH3O-(CH2CH2O)CH2CH2-OH,即将PEG一端的活性羟基用甲如 Kinslter等10在对G- CSF, sTNF-RI等进行PEG化时,发现PEG-丙醛在酸性条件下(pH=5)封闭,以减少或避免交联或团聚现象。2PEG修饰蛋白的原理与a-氨基的偶合具有高的选择性,这是由于a-氨PEG与蛋白的非必需基团结合后可作为一种基和其他亲核类基团相比具有较低的pKa值.亲屏障挡住蛋白分子表面的抗原决定簇,避免抗体的电类PEG符生物与氨基酸残基反应时很大程度上产生或者阻止抗原和抗体的结合而抑制免疫反应的取决于氨基酸残基的亲核性亲核反应只有在蛋白产生。蛋白经PEG修饰后,分子量增加,肾小球过水溶液的pH值高于或接近于残基的pKa值时才滤减少,PEG的屏障作用保护了蛋白不易被蛋白酶会发生口。另采用PEG醛的衍生物以及PEG羧酸降解同时减少了抗体的产生,这些均有助于蛋白药酯也可在蛋白修饰时具有较高的专一性口·太摄集团四南药业殷份有限公司·272Chinese Journal of Coal Industry Medicine Feb 2008, vol 11, No. 23.2PEG对巯基的修饰蛋白中的巯基主要为半( hydrazone)或与PEG-胺(PEG-amne)反应生胱氨酸残基所携带,由于蛋白表面半胱氨酸残基数成可逆的Sch碱( Schiff base)1用硼氢甲腈钠比赖氨酸残基数少得多,所以蛋白中半胱氨酸残基可将腙还原为更稳定的烷基肼化物,而Scif碱可被是一个很好的靶位可以实现对蛋白的特异性修饰。还原为仲胺。用PEG氨基进行还原性烷基化存在常用的PEG修饰剂及反应如图2。的主要问题是蛋白质上的氨基与PEG氨基具有相似的反应活性,就有可能形成交联聚集体。此情况下PEG肼化物就更为实用。PEG对蛋白羧基的修饰羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。通常在二环已基碳二亚胺(DCCI或1-乙基-3-二甲氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在下羧基可与氨基PEG结合,但同时也易产生其他的交联反应1。近年来发现PEG-酰肼(PEG- hydrazide)可与羧基特异结合。在EDC存在下,酸性条件(pH4.5~5.0)时,蛋白质中氨基被质子化而无交联反应的发生。反应如图3图1与氨基反应的PEG衍生物图3PEG-酰肼对羧基的修饰3.5PEG对蛋白的可逆修饰大多数PEG化化学的设计是使PEG与蛋白质之间形成稳定的连接-m一-“,键以利手属联物的览化和长期保存,但有时PEG会占据或屏蔽蛋白质的活性位点而降低其活性。另外,PEG偶联物分子量对于蛋白的活性有直接影响,分子量越大,则体外活性越低而体内活性越2) mPBG-CH-CH+sHR一mPB0cHC高。最优蛋白PEG修饰目标是既要延长药物的半衰期,又不降低药物的活性。mmdm,→ go-NHdw种方法是在蛋白和PEG之间采用可降解的化学键连接,然后在另外的条件或酶的作用下使蛋白从连接物上释放出来,从而恢复蛋白活性。例+SH-R如(见图4)。图2和骧基反应的PEG衍生物及其反应若蛋白中已有的巯基不理想,可采用基因工程手段将半胱氨酸引人到蛋白的特定位点,就可以采用对巯基有特异性反应的PEG衍生物对巯基进行R-NH高选择性修饰。但通过这种途径引入半胱氨酸,会增加不正确二硫化物和蛋白二聚的几率aPBC-0-CHALCHCL OCHCHICHL-NH-R3.3PEG对糖类残基的修饰对糖类残基的修饰也是一种定点PEG化的方法[1,糖类经过酶或化学氧化剂氧化,产生具有反应活性的醛基,这些醛基mPEGOCHaL0HCOH+ HOCR(CHa)H№可以和PEG-肼(PEG- hydrazide)反应生成腙图4蚤白和PEG双酯的结合与释放过程中国煤炭工业医学杂志2008年2月第11卷第2期273·影响PEG修饰反应的因素联分子数增加后,修饰不均一性也会增加。蛋白经过PEG修饰后,性质会有多方面的改4.7药物浓度药物浓度的增加增大了药物分子变6-1:①免疫原性和抗原性的降低;②循环半衰和聚乙二醇分子碰撞的机会能提高反应速率;但浓期的延长;③溶解性增加;④耐蛋白酶水解;⑤生物度增大的同时也增加了药物形成多聚体的机会,产利用度提高;⑥毒性减小;⑦热稳定性和机械稳定性物的均一性会减小。所以必须兼顾二者的平衡。增加;⑧等电点电泳行为以及动力学性质的改变。4.8反应时间随着时间的增加,产物的修饰率会同时,蛋白经修饰后,其生物活性会降低。影响因素增加,但产物的不均一性也会增加。有多种,主要取决于PEG化程度、PEG化位点及修以上因素对PEG修饰的影响对于不同的蛋白饰蛋白构象和电荷的影响等。所以有必要建立有所不同要根据蛋白本身特点,同时考虑修饰后的PEG修饰最优方案,以实现蛋白药物生物活性的保目的,修饰的程度、修饰位点的选择、产业化难易程留、一般性能的改善产品毒性减少,反应后产品的度及生产成本等因素,通过单因子及正交实验确定高回收率等。最优方案筛选应考虑如下因素最优反应工艺4.1修饰剂的选择修饰剂的选择应综合考虑修5结语饰剂的水解稳定性及反应活性、修饰剂与蛋白质M.J. Roberts等10提出PEG修饰的分代学,基酸残基之间反应专一性、修饰位点、修饰剂与蛋白第一代PEG技术主要限定于小分子量PEG,因为质连接键的稳定性、毒性、抗原性、修饰后是否需要在高分子量mPEG中含有大量二醇(聚合过程中水进一步分离是否适于建立快速方便的分析方法、修的存在所引起)。高二醇含量会引起很多的问题如饰剂是否能够简便快速地合成或购买等因素2],交联现象。另外,第一代PEG技术中低分子量4.2修饰反应的pH值pH值是PEG修饰蛋白PEG修饰没有选择性,也是由于小分子量PEG有的一个重要的因素因为它决定了具有潜在反应能更多的机会刺穿蛋白分子的表面,从而引起较多位力的功能基所处的可反应和不可反应的离子状态,点的结合。而第二代的PEG化技术避免了第一代般情况下,增加pH可以提高反应速率,降低技术的缺点,多采用高分子量PEG活性酯,同时改值会减小反应速率。同时控制合适的pH值可以对进了生产工艺,降低了PEG中二醇的含量,其应用蛋白中氨基酸残基进行特异性修饰,使修饰专一性越来越广泛[,1提高,从而提高收得率降低分离难度减少生产成经过PEG修饰的药物蛋白不仅较高地维持了本原药的生物活性,而且能够有效地降低或消除其免4.3药物与PEG的摩尔比通常情况下,随着疫原性和毒性。同时,由于分子量和交联度的增加,PEG和蛋白的摩尔比增加修饰蛋白的相对分子质修饰后的药物蛋白的循环半衰期显著延长。从而显量也会增加蛋白的修饰率会提高但修饰的不均一示了药物蛋白PEG修饰技术的良好应用前景。度也会增加生物活性保留会下降故必须控制合适6参考文献的比例,使蛋白修饰率最高,同时也尽可能保留蛋白[1]姜忠义,许松伟,王艳强蛋白质和肽类分子的聚乙的生物活性。二醇化化学[J]有机化学,2003,23(12):13404.4反应温度蛋白药物对温度的稳定性较差,要1347使蛋白药物修饰后仍然保留高的生物活性,反应必[2]K. Rajender Reddy MD, Marlene W. Modi PhD,s须在蛋白的耐受温度下进行。而同时温度也决定反应速率,影响修饰的均一性。对于巯基的修饰来说KD)(Pegasys) for the treatment of hepatitis C[].温度可以影响到活性巯基的微环境,仔细选择温度Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54: 571可以降低活性,防止一些竞争基团的反应4.5PEG分子量增加PEG的分子量可以延长[3] Yu- Sen Wang, Stephen Youngster, Micheal Grace药物的半衰期。而且支链的PEG比直链的更具有gylated recombinant interferon alpha- 2b and its优势,因为支链的PEG可以减缓在肾小球中的滤therapeutic implications[J]. Advanced Drug DeliveryReviews,200254:547-5704.6偶联的PEG分子数增加偶联的分子数等于[4] Veronese FM, Morpurgo M. Bioconjugation in phar增加PEG的分子量,因而也会延长半衰期。但是偶maceutical chemistry[J]. Inter J Pharmaco, 1999, 54,274·Chinese Journal of Coal Industry Medicine Feb 2008, VoL 11, No. 2istry and Biological applications[A]. Acs symposi[5] Zalipsky S Chemistry of poly (ethylene glycoDcon-um Series No680[C]. Washington, DC, Amerricanugates with biologically active molecules [J]. AdvChemicalDrug deliv Rev, 1995. 16:157[14] M. J. Roberts, M. D. Bentley, J M. Harris, et al.[6] Rameshraja P, Huashan W. Anil G. 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