酶法合成中合成酶的应用研究

中国食品添加剂试验研究China Food Additives-酶法合成中合成酶的应用研究陈华磊1.2，侯殿志12，于玥1.2，相萍萍1.2，朱延光1.2,蓝尉冰1.2.3,谢政1.2,姚晓麦12，陈山1.2.*(1.广西大学糖业工程技术研究中心，南宁530004;2.糖业及综合利用教育部工程研究中心，南宁530004; 3. 钦州学院，钦州535011)摘要:酶法合成因其高效无污染、专- 性强、杂质含量低、可连续化生产及产品分子量易控制等优点，逐渐成为现在制备生物大分子化合物研究的热点。尤其是合成酶的应用，为生物大分子化合物的酶法合成提供了一种更加有效便捷的方式。但是，目前酶法合成的相关研究尚处于探索阶段，合成酶的研究报道也较少。探索获得高活性、高稳定性的合成酶，是酶工程技术制备生物大分子的关键。该文就合成酶的种类及应用、作用机制、以及催化性能提升等方面的国内外研究现状进行了综述，对其应用前景及未来的研究方向进行了探讨。关键词:酶法合成;合成酶;作用机制;催化性能中图分类号: Q559文献标识码: A文章编号: 1006- 2513 (2016) 06- 0114-11Research on synthase application in enzymatic synthesisCHEN Hua1ei.”, HOU Dian-zhi!, YU Yue'.2, XIANG Ping ping' 7, ZHU Yan-guang'2,LAN Wei-bing' 2.3, XIE Zheng': 2, YAO Xiao-mai1.2, CHEN Shan!: 2.●(1. Engineering Center for Sugarcane and Cane sugar, Guangxi University, Nanning 530004;2. Engineering Center for Sugar and Comprehensive Utilzation, Ministry of Education, Nanning 500004;3. Qinzhou University, Qinzhou 535011)Abstract: Enzymatic synthesis has become a hot research topic in the synthesis of high molecular weight compoundsdue to the advantages of eficiency of the synthesis, pollution- free, high specificity, low impurity content,continuous producing and easily control of molecular weight.This study provides a more eficient and convenient wayfor the synthesis of biological macromolecules by enzymatic synthesis. The research of enzymatic synthesis is still inthe exploratory stage and the reportsare few. To explore high activity and high stability of the synapses is the key in theenzyme engineeringof preparation of biological macromolecules. In this paper, the types and aplicaion of enzymes,the mechanism of action, and the improvement of the catalytic performance, as well as other aspects of domestic andforeign research status are reviewed, and its application prospects and future research directions are discussed.Key words: enzymatic synthesis; synthase; mechanism; catalytic properties传统生物法合成大分子化合物一-般 利用菌体应体系比较复杂，存在诸多问题。首先，发酵工发酵法，但是菌体发酵法制备大分子化合物的反程菌种的筛选比较困难，菌种筛选周期较长，菌收稿日期: 2016-03-11*通讯作者中国煤化工基金项目:国家自然科学基金项目(21264003) ; 2013 年广西自然科学基金项目(2013作者简介:陈华磊(1989 -), 男，硕士，研究方向:糖厂副产物综合利用与糖类药物开MYHCNMH GL 114“2016年第6期中国食品添加剂:试验研究China Food Additives-活性。右旋糖酐蔗糖酶与蔗糖共价键联结在一其中，以蔗糖为底物，在无其他受体情况起，并将蔗糖分解放出果糖，形成D- -glucosy1-下， 首先催化蔗糖分解生成与酶连接的D-葡萄Enzyme [45。在酶催化的情况下，反应可向四个糖基和果糖，然后将D-葡萄糖基转移到右旋方向进行1461: (1)聚合产生右旋糖酐; (2)在糖酐残基的C3/C6位置或水分子上，合成右旋H2O的参与下，分解生成葡萄糖; (3)在外界受糖酐糖链或水解蔗糖，催化合成机制如图2-1体的参与下生成低聚糖; (4) 逆向反应。所示(471。o的rx③②①rx ⑤Lxexo①x°D③-②-0的图2-1右旋糖酐蔗糖酶催化合 成右旋糖酐的机制[47]1Fig.2 1 Mechanism for dextran biosynthesis by dextransucrase.(X,和Xz代表酶活性位点的亲和团: O代表葡萄糖; <代表果糖; 0- -<代表蔗糖;0-0表示两个由a- 1. 6糖苷键链接的葡萄糖基团.)右旋糖酐酶蔗糖酶除能合成右旋糖酐外，当被移至-条右旋糖酐链中得到以右旋糖酐链作为有可识别外源受体(如麦芽糖)存在时，右旋糖分支部分的右旋糖酐(511 ; (3) D-葡萄糖基部分酐蔗糖酶可以将D-葡萄糖基转移到外源受体上被转移至水中，蔗糖水解1521; (4) 右旋糖酐链合成各种糖基化产物，如功能性低聚糖等(48。受移至水中，或者与受体(D-葡萄糖、D-果糖、体反应主要有以下四个方面: (1) D-葡萄糖基蔗糖、麦芽糖)结合，从活性位点处释放右旋糖部分被移至受体单糖或低聚糖中149. s0|; (2) D-酐，聚合反应终止(50, 52。葡萄糖基部分被移至右旋糖酐链中形成葡萄糖基2.2交替糖蔗糖酶的作用机制支链，或是D-葡萄糖基部分和右旋糖酐链一起2n times●f图2- -2交 替糖蔗糖酶合成交替糖的作用机制(5]1Fig.2- 2 Reaction mechanism of alternan synthesis catalyzed hvalternaneurrace.中国煤化工(●-d;蔗糖，●:葡萄糖，<:果糖TYHCNMH G118I 2016年第6期.试验研究中国食品添加剂.China FoodAdditives交替糖蔗糖酶的作用机制与右旋糖酐蔗糖酶淀粉蔗糖酶的催化反应过程是将供体质子注的作用机制较为相似153。交替蔗糖酶先断开蔗糖人到糖苷键中，对部分葡萄糖的异头碳进行亲核的糖苷键，将葡萄糖残基转移给受体分子，生成攻击形，成共价连接的底物-酶中间产物，中间产低聚糖或多糖，释放果糖(54。酶活中心可以与葡.物可以和水分子发生水解反应，也可以和糖分子萄糖残基C3、C6位连接。当只有蔗糖为反应底发生转糖基作用(21。只以蔗糖为底物时，淀粉.物时，其中一个位点上的葡糖基中间体C6.上的.蔗糖酶首先水解蔗糖为- -分子葡萄糖和- -分子果羟基亲核攻击另一个葡糖基-酶中间体C1上的糖。接着,水解得到的葡萄糖分子通过a-1, 4羟基，形成a-1, 6糖苷键;而另外一个位点上糖苷键连接， 聚合生成线性结构的a-1, 4-葡聚的葡糖基中间体C3.上的羟基亲核攻击另一个葡糖聚合物， 使糖链伸长一定长度。在转糖基作用糖基-酶中间体C1上的羟基，形成a-1, 3糖下，淀粉蔗糖酶可以将蔗糖水解产生的葡萄糖分苷键。以这样的方式合成a-1, 6糖苷键和a-1，子和果糖分子又一次结合， 生成蔗糖的同分异构3糖苷键交替连接的交替糖。其作用机制如图体松二糖; 还可以生成蔗糖的另- -种同分异构体2-2所示1531。当底物为蔗糖和可以与酶连接的单海藻糖。 此外，在只以蔗糖为底物时，还会生成糖或双糖时，交替糖蔗糖酶发生受体反应，形成麦芽糖、 麦芽三糖等其他副产物(231。 其作用机制a-l，3糖苷键或a-1, 6糖苷键，生成不存在2如图2- -3所示156。当有淀粉、糖原等为受体时，个连续的a-1, 3糖苷键(或2个连续的a-1, 6蔗糖水解产生的葡萄糖 分子为供体，依次连接到糖苷键)的小分子低聚糖19. s。淀粉或糖原上得到具有拓展结构的物质1571。2.3淀粉 蔗糖酶的作用机制CHOHCH.OHAmylosucraseHydrolysis! CHou)HOHoHSucroseGlucoseFructoseH_O! CHOHTransglycosylation Type I身Linear a-(1,4)-glucan+, CHOTransglycosylation TypeIl o1ouTuranose图2- -3淀粉蔗糖酶的作用机制 [56)Fig.2-3 Reaction mechanism of Amylosucrase2.4脂肪酶的作用机制三联体(Ser-His-Asp 或Ser-His- -Gly)，被埋脂肪酶在非水相体系中具有酯化、转酯、胺在分子中。脂肪酶活性部位的Ser残基被a-螺解和醇解等特性，这些特性使其在有机物合成中旋形成的中国煤化工“盖子”覆MCHCNMHG'得以广泛应用(58)。 脂肪酶活性部位为亲核催化盖在活性中心..n.1s,时的与活性中心的1192016年第6期.中国食品添加剂试验研究China Food Aditives结合被阻止，三联体活性部位被保护。当与界面物a与脂肪酶活性中心结合，接着与脂肪酶酰化接触时，由于亲电子域作用，脂肪酶构象发生了形成第一个过渡态四面体，此过渡态与两个主链改变，a-螺旋形成的“盖子”打开，暴露出活氮原子构成的结构内的氨基酸碳架上-NH反应性中心，与底物结合，催化反应开始进行。界面生成酰化酶中间体，同时释放出产物a;第二步,还可以使酶形成不完全水化层，使酶催化更易进底物b作为亲核试剂，使酰化酶中间体脱酰化形行[59. 60。脂肪酶催化机理遵循Ping- Pong Bi-Bi成第二个过渡态，同时生成产物b,脂肪酶恢复反应机理(61.621，反应有两个底物/酶过渡态和一-到自由酶状态，如图2- -4所示(591。个酰基化酶中间态，分为两步进行:第一步，底ROXRIHisSubstrate I公96Asp.N③N、°←RI8“HHO、H-ierFree enzymeTetrahedral intermediatein the acylating step0Ho^RI~)H2His R3 -OHAsn336-ACoA3延伸4环化图2-5 I1 型PKS的催化作用机制163. 61Fig.2- 5 Catalytic mechanism of type II PKS性的高酶活力，即使第六批次反应时转化率仍可3合成酶催化性能的优化维持在40%左右，固定化酶比游离酶的热稳定合成酶是一种高效生物催化剂，具有底物专性好，但固定化酶的酶活比游离酶的低。尹春丽一性强、 催化效率高和反应条件温和等优点，但等1631 以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，对S-也存在对酸、碱、热、有机溶剂稳定性差等缺腺苷甲硫氨酸合成酶进行固定化，固定化酶活性点，限制了酶的相关应用。此外，现有商品级的回收率为76%，酶的稳定性都较好。Rastian 等合成酶种类不多，大多都是自己进行提取、分离1661采用介质阻挡放电等离子体法在多壁碳纳米管纯化而得，其分离纯化方法会对酶活力有很大影上引人羧基和氨基官能团，再将皱褶假丝酵母脂响。探索获得高活性、高稳定的合成酶,是酶法肪酶通过物理吸附固定在功能化的多壁碳纳米管合成大分子化合物的关键。目前，提升合成酶催上，相比于游离酶，固定化酶的活性、热稳定性化性能常用的有效方法有:酶的固定化、酶的化和重复使用性都得到显著提升。学修饰、突变菌得酶等。3.2酶化学修饰3.1酶的固定化酶化学修饰，就是在分子水平上对酶进行固定化可显著增强酶的稳定性。固定化酶技改造，包括:在已知酶的结构与功能关系的基础术是采用物理或化学方法将游离的酶固定于限定上，有目的地改变酶的某- -活性基团或氨基酸残的空间区域，使其保持较高的活性，实现反复利基，从而使酶产生新的性状:利用大分子或小分用的方法。张洪斌等171以4%海藻酸钠和1%琼子修饰剂对酶分子的侧链进行改造。化学修饰是脂按1 : 1 (V/V)混合作为载体固定化右旋糖提高和改变酶代化媒能的右部士法利用化学修酐蔗糖酶生产右旋糖酐，该固定化酶表现出持续饰法可快速中国煤化工甚至合成出新的酶。THCNMHG'M元芬馍Bβ-D-呋喃12112016年第6期r