降纤酶的聚乙二醇修饰及产物的纯化研究

234中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals0037(4)微生物药物与生物技术降纤酶的聚乙二醇修饰及产物的纯化研究武霞,冯军,赵文杰(上海医药工业研究院,上海200040)摘要:研究了降纤酶的聚乙二醇修饰及纯化方法。采用正交法考察影响修饰的4个因素,确定了最住条件。利用分子筛柱色谱得到了较高酶活力保留的修饰产物,SDs-page检测为单一条带关键词:降纤酶;聚乙二醇:正交实验:纯化中图分类号:TQ464.8文献标识码:A文章编号:1001-8255(2006)0-0234-04降纤酶(defibrase,Df)已在临床广泛应用,如分子筛柱色谱分离:色谱柱 Superdex775柱;流去纤、抗凝、降脂、扩张血管和改善微循环等。但动相0.05mol/na2hp4-nah2PO4缓冲液(pH7.0):作为异源蛋白,Df在使用中不可避免地具有蛋白质检测波长215m;流速0.3ml/min。收集0.5m/管。类药物的共同缺点,如具免疫原性、半衰期短、稳定HPlc测定:色谱柱 Waters Symmetry300C4性差等23聚乙二醇(PEG)修饰技术是近年来发柱(3.9mm×150mm,5um);流动相A:0.1%三展的用于改进蛋白质类药物体内药物动力学性质的氟乙酸、B:乙猜-0.1%三氟乙酸(9:1);梯度洗新技术,它将单甲氧基PEG分子(mPEG键合到蛋脱:0~18min,流动相B20%~70%,18~白质分子表面,改变蛋白质的空间结构,进而改变其20min,流动相B70%~50%;检测波长215nm;生化性质此法可有效降低蛋白质的免疫原性,延长柱温37℃;流速1.0ml/min半衰期,减少给药次数本研究考察了PEG修SDS-PAGE电泳:参考文献81。分离胶12.5%,饰Df的条件及目标产物的纯化。浓缩胶4%。1仪器与试药2.2f的修饰反应910 AKTA explorer蛋白质分离纯化仪、ds-pg仪均为取1mg/ml的Df溶液2ml与0.2mol/Lna2P4- Amersham Pharmacia Biotech公司产品高效液相色谱仪Na2HPO4缓冲液(pH6.5)4ml混合,加入mpeg-sp(Waters公司)alegrax-《wasgaAewxcug,360mi《冷冻离心机5固体6mg溶解,混匀,37℃反应60min反应(Beckman Coulter TM公司):超滤器(Millipore公司)前后分别取适量混合液以pH7.4的Tris溶液稀释,Df(M38k,河南省中泰药业有限公司)mpeg-A测定酶活力,计算酶活力保持率。加入甘氨酸3g终(M5k、30k,丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯)mPEG止反应。超滤(截留分子量10000)至0.5ml,待分离SBA(酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯)均为美国 Shearwater纯化,产物记作mf5k公司产品。另以mPEG-SPA30k、mPEg-SBA分别进行Df2方法与结果的修饰反应,方法同上。产物分别记作mDf30k和2.1主要测定方法 mDf-SBA.蛋白质浓度测定:采用 Lowry法。2.3Df的PEG修饰条件选择Df活性测定:参照卫生部药典委员会颁布标准将影响修饰结果的4个影响因素:反应缓冲液(试行)测定。pH(A)、Df与PEG的摩尔比(B)、反应时间(C)和反应温度(D),进行3水平正交实验,具体设计见收稿日期:2005-01-26作者简介武霞(1977),女,硕士研究生专业方向:微生表1。通过考察修饰后酶活力保持率和修饰率来确物与生化药学。定最佳修饰条件。已修饰Df(mDf)量通过分子筛柱Tel:021-62479808×426 e-mail: wuxial202@163.com色谱图中的面积计算。中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals200637(4)235表1L(3的因素水平表产物为混合物,故未进行修饰反应条件的筛选。因素2.4修饰产物的纯化水平AB C/hD/℃2.4.1sds-pge电冰验证修饰产物6.51:20237.01:100.57.51:52487分别对各修饰反应产物进行SDS-PAGE电泳验证,见图1A~CmPEG-SBA修饰Df的产物电泳试验结果表明,在pH6.5、Df与PEG摩尔比图上出现数条M增大的条带;mpeg-spA5k修饰为1:20、反应时间1h、温度37℃的条件下,产Df的电泳图上则有一条M增大的条带,M约为物可保持较高酶活力,且修饰率最高。产物mDf43kmpeg-spa3ok修饰Df的电泳图上有条M5k的酶活力保持率53%、修饰率46.7%。mDf30k增幅更明显的条带(图1C),M约为97k的酶活力保持率46.9%、修饰率38.2%。因mf-sBA123123412397.4k97.4k66.2k43.0k97.4k66.2k43.0k31.0k43.0k31.0k31.0k20.1k14.4k20.1k20.1k14.4k14.4kABC1-Df:2标准分子量蛋白1标准分子量蛋白:2-Df1标准分子量蛋白;2-Df;3—修饰反应液3修饰反应液;4-mDf5k3一修饰反应液图1Df与mG-B(A)、mpeg-spa5k(B)、mpeg-spa30k(C)的修饰反应电泳图2.4.2 Superdex775分子筛柱色谱应液经分子筛柱色谱分离后,所得色谱图见图2Df的mpeg-pa5k和mpeg-30k修饰反A mAU 200 mAU 40010020051510i5 t/min t/minA:mpeg-spa5k修饰反应液,B:mpeg-spa30k修饰反应液 1-Df: 2-mDf 5k; 3-mDf 30k图2修饰反应液的分子筛柱色谱图谱2.4.3HPLC分析取柱色谱分离后收集的单一峰浓缩,再进行分别取Df、柱色谱分离后收集的Df5k、 mDf SDS--pag验证结果与“2.4.1”项下类似:30k纯品适量,按照“2.1”项下条件进行HPLC mPEG--spa5k、mpeg-sp30k修饰Df分别得到分析,色谱图见图3。M约为43000、97000的产物mDf5k、mDf30k2.4.4sd-Age电泳验证纯化产物3讨论236中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 22006,37(4) AU.15 AAu0.250.20B20.100.100.150.050050.100.000.050.000.000.050.050.05-0.100.10-0.100.0.15246810121416182024681012141618202468101214161820 tmin tmin timinA:Df,B:mDf5k收集液,C:mDf30k收集液 1-Df: 2-mDf 5k; 3-mDf 30k图3PC色谱图mpeg-sBa修饰Df所得的mDf是多位点、多【2]正峰张华李成建去纤酶的不良反应医药导报分子量的(如图1A)。而用SDS-PAGE、分子筛柱2002,21:136色谱和HPLC3种方法共同验证得到结论:mPEG[3]郑万刚降纤酶不良反应12例分析[蛇志1998(3:32SPA修饰Df可以得到纯度较高的 mDf mPEG-spa4] Bures, Huang Oraletl Surface modifications and5k修饰产物的M1约为43000,符合Df与mPEG-SPA molecular imprinting of polymers in medical and5k之和;mPEG-SPA30k的修饰产物在电泳图谱上 pharmaceutical applicationsUJ]. J Controlled Release, 2001.72(1-3):25-33的M,却远高于Df与mPEG-SPA30k之和,可能有 [5] Zalipsky S. Chemistry of polyethylene glycol conjugates with两个原因:一是由于线状PEG分子伸展在蛋白表 biologically active molecules [)] Adv Drug Deliv Rey, 1995.面,使蛋白泳动速率降低;另一原因可能是PEG的16:157-182水化程度非常高,故在SDS-PAGE上表现异常。据文献报道,蛋白质类药物的PEG修饰中, and other therapeutic proteins and peptides: the importance经常遇到的问题是反应产物不均一,包括分子量大 of biological optimization of coupling techniques[J]. Int J小不一、修饰位点各异等,且在修饰过程中酶活力降 Hematol,1998,68(1):1-18.低较多。Wang等(2在进行人重组干扰素a-2b的PEG7]李建武萧能素,余瑞元,等生物化学实验原理和方法[M]第二版,北京:北京大学出版社,1997.168-170修饰时,产物多达13个,修饰后酶活力最高仅为8 Amersham Pharmacia Biotech Protein electrophoresis tech37.0%,最大修饰率仅为47.8%。而本研究在最佳 nical manual [M]. USA: Amersham Pharmacia Biotech. 13.修饰条件下得到单一的修饰产物,mDf5k酶活力可19保持53%,修饰率为46.7%mDf30k酶活力保 Kinstler OB, rems DV Lauren SL,etal. Characterization持率为46.9%,修饰率为38.2%。因PEG分子量 and stability of N-terminally PEGylated rhG-CSFUJ]. Pharm的增大,进一步影响了酶活中心的正常功能,使酶活Res,199613(7):996-1002力保持率降低本研究组将在后期工作中,对修饰产[10]李伟军林炳承苏志国聚乙二醇共价修饰药用蛋白质的分析方法[].分析化学,200129(2)228-231物酶的理化性质、免疫原性、半衰期等进行进步试 [1] Roberts MI, Bentley MD, Harris JM. Chemistry for peptide验,考察其能否最终成为Df的改良药物,达到更好 and protein PEGylation [] Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54疗效。(4):459-476 [12] Wang YS, Youngster S. Grace, et al. Structural and biologi-参考文献: cal characterization of pegylated recombinant interferon al-[1]张惠,王永茂降纤酶的临床应用[]现代中西医结合杂 pha-2 b and its therapeutic implications ] Adv Drug Deliv志,2003,12(12):1323.Rev,2002,54(4):547-570中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals2006,37(4)237还原型谷胱甘肽的金属螯合亲和色谱纯化潘飞,邱雁临*湖北工业大学生物工程学院,湖北武汉430068)摘要:制备了以壳聚糖为载体的金属整合亲和色谱分离纯化还原型谷胱日肽(GSH)。研究了pH、铵离子浓度等对GSH洗脱的影响。根据试验结果确定洗脱液为pH4.2、0.2mol/磷酸盐缓冲液(含0.5mo NHC),所得GSH纯度可达49.8%,平均提取率为67.9%。关键词:还原型谷胱甘肽;金属整合亲和色谱;壳聚糖中图分类号:Q516文献标识码:A文章编号:1001-8255(2006)04-0237-03谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨得到富含GSH的酵母抽提液。另以壳聚糖为载体、酸缩合而成的含巯基的生物活性三肽化合物,有还Cu2+为配基制得金属合剂,以酵母抽提液上柱分原态(SH)和氧化态(GSSG)两种GSH有多种离,考察了洗脱条件对纯化结果的影响。生理功能,对维持生物体内适宜的氧化还原环境尤1仪器与试剂为重要[21,临床用于中毒性和感染性肝炎的治疗3、c-6型高效液相色谱仪(日本岛津) Nexus傅里叶变有机物及重金属的解毒、癌症辐射和化疗的保护换红外光谱仪(美国 Nicolet公司)722型可见分光光度计等6壳聚糖是天然的氨基多糖,生物相容性与(上海精密科学仪器有限公司)吸附性均较好,可直接或经修饰后用作各种色谱和啤酒酵母泥(华润集团武汉东西湖啤酒公司);壳聚糖蛋白质分离纯化的载体金属离子亲和色谱是新(市售,分子量270k,脱乙酰度87.22%);亚氨基二乙酸兴的色谱技术,利用Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+钠、5,5二硫二(2-硝基苯甲酸)(DTNB);GSH对照品等金属离子与蛋白质表面的组氨酸、色氨酸或半胱(Sigma公司,含量98%);Tris生化试剂(Amresco公司)氨酸配位结合,由于氨基酸种类、数量、位置及庚烷磺酸钠(美国Regis公司):其余试剂均为分析纯空间构象不同,故与金属离子亲和力大小不同,从2方法与结果而选择性地分离纯化82.1GSH提取液的制备本研究通过对啤酒酵母的预处理及细胞破碎,啤酒酵母泥经预处理(包括过筛、除杂)得到净的啤酒酵母后,按1:2(w/v)的比例将0.5%对收稿日期:200-8-11基金项目:湖北省教育厅重大项目(20032001)羟基苯甲酸丙酯溶液加至菌体中,30℃、pH5~6作者简介:潘飞(1980),男,硕上研究生,专业方向:多肽搅拌3h离心(100rmn)10min,上清液加入药物。Tel:013277053767絮凝剂壳聚糖使其终浓度为0.1%(w/v),搅拌 E-mail: pf_sky@163.com通讯联系人:雁临(1942),女,教授,博士生导师,从事再10min,离心(1r/min)10mn后取上清液备用生资源的微生物转化研究。2.2亲和色谱剂的制备Tel:027-88016421 e-mail: hgqiuyl@126.com壳聚糖3g溶于1%乙酸溶液100ml,搅拌2h,哈哈66哈666哈6666哈6666666哈6666666666 Defibrase Modified by PEG and It's Purification WU Xia, FENG Jun, ZHAO Wen-Jie (Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200040) ABSTRACT: Defibrase modified by polyethylene glycol(PEG) and it's purification were studied. Four factors were determined by orthogonal experiments. The PEGlation defibrase with high enzyme activity was purified by molecular sieve column chromatography, and showed single band on SDS-PAGE. Key Words: defibrase; polyethylene glycol; orthogonal experiments;purification