药物蛋白的聚乙二醇修饰

离子替代等相结合的方法。另外还可结合胞内代谢产物扣[7] Bertaso F, Hendry BM, Donohoe p. Alterations in out ward K制的方法进行通道分离和鉴别。再有就是基因筛选克隆并currents on removal of extemal Ca2+ in human atrial my[J]. Biochem Biophys Res Commun 2000 273 1 ):10表达不同通道亚基的方法能够达到分离通道的目的如卵母[8] Koumi s. Backer CL, Arentzen CE. Characterization of in wardly细胞或人工质膜表达可以作为膜片钳技术的辅助手段。随rectifying Knel in human cardiac myocytes. Alterations in着对离子通道门控特性和调控机理认识的深入将有更多分channel behavior in myocytes isolated from patients with idio.离和鉴定方法得到应用。thie dilated cardiomyopathy[ J ] Circulation, 1995, 92(2)8结语[9] Frazier CJ, George EG Jones SW. Apparent changes in ion selec膜片钳技术以其实用、快速、灵敏、准确及重复性好等技tivity caused by changes in intracellular K during whole-cellrecording J]. Biophys J 784): 1872术优势已经在大量的研究中得到证实。这一技术发明至今[10] Zhou WG, Fontenot j, Liu s,et. Modulation of cardiac calcium已有20多年历史国外20世纪80年代中期用此技术进行hannels by propofo[ J ] Anesthesiology 1997 86 670研究并推广国内20世纪90年代初引进这一技术。但国内[11 Nygren A, Fiset C, Firek jw,n. Mathematical model ofatrial cell the role of K currents in repolarization目前由于多种原因用此技术进行心血管药物与心肌细胞离. Circ res,l9988x1)为3子通道的研究相对还多停留在动物细胞阶段。种属及组织[12] Priebe l, Beuckelmann DJ. Simulation study of cellar electric差异使得实验数据与人或临床的联系上还有一段距离亟待[13]ha￥, trom JA, Furukawa T Charact采用人体细胞进行大量的研究这也是今后药物研究(包括the sodium current in single human atrial myocyte J ]. Cric Res麻醉药物舶一个热点领域。随着在分子水平上对心脏离子199271(3)535通道门控动力学及调控机制的认识,也将使进一步揭示心肌[14] Schneider M Proebstle T Hombach V,et al. Characterization ofthe sodium currents in isolated human cardiocyte J]. Pfuegers细胞的生理和病理生理过程成为可能。Arch 1994 428 84参考文献15 Renate H Frank S Stephan H et al. Single-channel properties of[1]方福德周吕,丁濂等.现代医学实验技巧全书(下册IM]L-type calcium channels from failing human ventricle[ J ].Car-北京北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1995[16] Mewes T, Ursula R L-type calcium currents of human[2] Kitamura H Yokoyama M Akita H et al. Tertiapin potently andfrom ventricle of non-failing and failing hearts and from[J]. J Mol Cell Cardiol 1994 26: 130selectively blocks muscarinic K' channels in rabbit cardiac my- 17] Quadid H, Albat B, Nargeot J Calcium currents in diseased hiocyte[ J]. J Pharmacol Exp Ther 2000 293(1): 196[3 J Nenov NI, Crumb WJ, Pigott JD , et al. Quinidine interactionman cardiac cell J]. J Cardiovasc Pharmaco!, 1995 25282with human atrial potassium channels-developmental aspect[J]. [18] Li GR Feng JL, Wang ZG et al. Comparative mechanisms of 4.Circ res,998428):1224ninopyridine-resistant Ito in human and rabbit atrial myocyt[4]赵颖胡大一杨新春等肽类血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对心[J]. Am J Physiol, 1995 26 38 ): H463肌细胞离子通道的影响J中华心血管病杂志2008X1):[19] Li GR,Feng JN, Yue Lx et al. Transmural heterogeneity of adion potentials and Itol in myocytes isolated from the human rightventricl J]. Am J Physiol, 1998 275 2 Pt 2 ) H369[5] Hamill OP, Martty A, Neher E, et al. Improved patch-caI 20] Amos GJ, Wettwer E, Metzger F et al. Differences bet ween out-echniques for high-resolution current recording from cells andcell-free membrane patched J ]. Pfluegers Arch 981 39185ocyte[ J ] J Physiol. Lond ),1996A91 31electropharmacological studie[ J]. Pharmacol Res 2000 Ax 1): [21 Noma A ATP-regulate K' channels in cardiac muscle J ]. Notrel983305147(收稿日期2001-0305)药物蛋白的聚乙二醇修饰姜忠义高蓉许松伟王艳强(天津大学化工学院天津30002)摘要泪目的较为系统地了解药物蛋白的聚乙二醇修饰过程。方法根据现有文献就聚乙二醇类修饰剂选择、修饰反应原理与操作祭件、过程设计与产品纯化、生物化学和生物学分析定性等问题作出简要论述。结果与结论聚乙二醇修饰后的蛋白质被赋予了许多新的物理化学和生物学特性以及临床效果得到了明显改善显示了药物蛋白的聚乙二醇修饰的良好应用前景中国煤化工关键词聚乙二醇沘学修饰药物蛋白CNMHG中图分类号TQ464.7R977.6文献标识码文章编号J2人作者简介姜忠义男博士副教授Tel(022)27890882Fax(022)3513454E-mailzhijiang@mail.zdnet.com.中国药学泰握6月第37卷第6Chin Pharm /,2002 June, Vol, 37 No. 6.409蛋白质药物主要有蛋白质激素和干扰素、血浆蛋白质蛋白质类生长调节因子和神经营养因子、黏蛋白、胶原蛋白mPbG-O-COCH: 000-N琥珀酰胶类CH oc碱性蛋白、蛋白酶抑制剂和植物凝集素、白细胞介素、集落刺激因子等1。蛋白质药物由于具有作用专一、高效等特点PEG--O-C-N-C-C-OH而在人类健康中发挥着日益重要的作用。蛋白质药物的原HN—PEG—OHmPEG-0-OOO-N异墙双功能类料有动植物细胞和微生物细胞等非人体来源。若将非人体mPEG-O来源的药物蛋白通过静脉注射到人体后常常刺激机体的免甲酰胺类疫系统使之产生特异免疫应笞产生对该种蛋白的抗体。继PEG-o-CH-CH-CHmPEG邳氧类续注射该种蛋白就会产生过敏性反应。即使不产生过敏反mPEG=CH3-(OCHCH)n-OH应免疫应答也会导致蛋白质的失活或加快蛋白质的代谢mPEG= CH3-(OCH, CH )n-OH从而降低药物蛋白的疗效2.蛋白质药物的疗效不仅取决图1常用的PEC类修饰剂于蛋白质特定的化学结构而且还取决于其特定的空间结和修饰反应形成的连接键类型有:①羟基琥珀酰胺脂类构因此可以通过基因工程、化学修饰等手段部分或全部解(NHs酯酰胺键)环氧化类(烷基键)洶羰基咪唑类尿决蛋白质药物的缺陷其中化学修饰以其灵活多样、简便易烷键)④硝基苯基碳酸酯类尿烷键)⑤三氟乙基磺酸酯类行的特点而得到了较为广泛的应用3烷基键)⑧醛类(№末端κchif碱)1聚乙二醇类修饰剂PEG修饰剂通过伯胺基团与蛋白质的反应常常会形成化学修饰剂与蛋白质的反应主要有酰化反应、烷基化反不均一的偶合物。不均一主要是指蛋白质分子中同一基团应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等。代表性的修饰剂被某一修饰剂修饰时其化学反应性不相同以及不同的基团有醋酸酐、乙酰咪唑、乙二醛、右旋糖苷、肝素、葡聚糖、乙可以与同一种修饰剂发生同一性质的反应。为改进修饰的酸/丙二酸的共聚物羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮聚1,不均一性对蛋白质表面的其它官能团进行修饰的方法也有3-乙二醇次甲基醚、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、聚氨基酸、大量的研究报道。这些官能团主要包括游离的半胱氨酸、寡多聚唾液酸坏糊精、聚乙二醇等其中以聚乙二暾PEG)糖羟基等。用作修饰特殊位点的PEC衍生物有①乙烯基修饰剂应用最多磺酸修饰游离的半胱氨酸)¤碘乙酰胺修饰游离的半胱PEG是一种两亲性聚合物由重复的乙烯氧亚单元组氨酸):马来酰胶修饰游离的半胱氨酸);正吡啶二硫化成每个乙烯氧亚单元的相对分子质量为44。PEG活性较物修饰游离的半胱氨酸)⑤酰朓修饰寡糖):异氰酸酯低无毒而且末端有两个能被活化的OH基团。为了获得(修饰羟基或氨基)单功能的PEG,一般将PEG的一端转化为甲氧基或其它的2.2修饰反应的影响因素14烷氧基。除了线形PEG还有星形PEG即通过中间物如赖影响PEG修饰过程的主要因素有蛋白质浓度、蛋白氨酸、三嗪等将两上或更多的PEG链连接在一起5。质与PEG修饰剂的摩尔比灣修饰反应的pH值和离子强PEG类修饰剂与其他修饰剂相比毒性小无抗原性具度③修饰反应温度修饰反应持续时间。有良好的两亲性且生物相容性已经得到FDA认证特别是通过正交实验设计得到适宜的修饰反应条件。通过对当蛋白质经过PEG类修饰剂修饰后,修饰剂的许多优良性个或多个操作因素的控制就可以得到所需的连有单个、质也会随之移植到修饰蛋白中。常用PEG类修饰剂见图1。两个、三个或多个PEG的蛋白质偶合物。不同种类的PEG修饰剂表现在都能较容易地合成出来或直2.3PEG修饰过程设计接购买但不同的修饰剂化学反应性和纯度等均有所不同。蛋白质的PEG修饰反应可以在固相和液相中进行据估计能阻碍肾和细胞清除的最佳PEG相对分子质量为4万~6万6。PEG与蛋白质偶合时有三种不同的方2.3.1液相反应在典型的液相PEG修饰反应中蛋白质与PEG的摩尔比一般为1:3~5反应pH值维持在7~8之式门单个大分子量PEG修饰蛋白质的单一位点湦形PEG间温度保持在4~8℃反应持续8-16h然后用冰醋酸调两个或更多的中等分子量PEG通过交联连接在一起)修饰节pH值到4.5来终止反应。反应混合物用水稀释后在阳离蛋白质的单一位点几个小分子量PEG修饰蛋白质的多个子交换柱上进行吸附分离将剩余的PEG和反应副产物洗位点。理论上因为在受体结合域内受体与PEG结合的机掉。修饰蛋白与未修饰蛋白可以通过提高缓冲液中盐的浓会减少单一位点被PEG修饰的蛋白质应该有较高的活性。多位点的PEG修饰或大分子量PEG的应用往往会导致蛋白度来分离。典型的纯化方法如下所示。质部分或全部失去生物活性8-1V凵中国煤化工释→阳离子交换→洗滤2修饰反应CNMHG2.1修饰反应的类型与途径12-1312.3.2回相戊厘仕回相以PG修饰反应中蛋白质被吸附到离子交换柱上在规定的时间内PEG修饰剂不断地循最常用的修饰反应是亲电活化的PEG修饰剂与赖氨酸的ε-氨基或蛋白质N-末端的氨基反应典型的PEG修饰剂环流过柱子。反应结束后用缓冲液将过量的PEG和其它的副产物洗掉。当未修饰蛋白仍被吸附在柱子上时,可以改410.万摒。larm J, 2002 June, Vol 37 No 6中国药学杂志2002年6月第37卷第6期变缓冲液中盐旳浓度将修饰蛋白脱附下来。分析洗脱液确药物蛋白被PEG修饰后在临床应用中显示岀优良性质。具定蛋白质的修饰度。柱子用相同量的未修饰蛋白再生以便体体现有物理和热稳定性的增强对酶降解敏感程度的降下次循环操作时能够保持相同蛋白质浓度。同上所述,低溶解度的增大在体內循环半衰期、清除时间的增长免EG再一次循环进行修饰反应然后再修饰蛋白脱附下来。疫原性和抗原性的降低及毒性的减小等。另外修饰的作用在固相PEG修饰过程中反应、分离、提纯能够在同一根柱还表现在体内活性提高而体外活性降低。该作用在集落刺子上进行并且能重复多次。激因子GM-CSF白介素2(1L-2厢和白介素6(IL-6)肿瘤3修饰蛋白的分析与表征坏死因子TNFa)γ干扰素IFNy及其它生物分子上也得3.1蛋白浓度的测定151到了体现24类似与普通的蛋白质浓度测定紫外分光光度法、PEG修饰后的蛋白还具有下述优点生物分配行为变法、二宁可辛酸BCA法、 Bradford法或其它一些更可靠和准化生物学性质变化灣膜的渗透性提高。很小剂量就能确的氨基酸组成分析方法等均可用于修饰蛋白的浓度测定。取得持久临床效应从而提高了生命质量降低了治疗成本。3.2 SDS-PAGE分析般PEG偶合的生物大分子与未修饰的分子相比呈按照 Laemmle所叙述的方法进行 SDS-PAGE实验首现出不同的物理、化学性质。这些改变的性质包括构象、空先对凝胶进行特异性染色针对PEG的染色方法采用改进间位阻、静电结合性质、疏水性、赖氨酸的pK可用来衡量可的 Kurfurst方法。SDs-PAGE凝胶用蒸馏水淋洗后浸泡在反应的完成程度和等电点。与受体连接的亲和力经常受5%的氯化钡溶液10min再用蒸馏水将氯化钡洗掉浸泡在到这些物理化学性质变化的影响因而以细胞为基础的体外0.1molL-1 TitrisolTN(碘溶液)0min然后再用蒸馏水将活性检测测得值有所降低。药物蛋白在体内的生物活性与Titrisoltn洗掉将凝胶浸泡在蒸馏水中装入经过热密封的偶合的PEG量有着正比的关系。然而体外的生物活性却Kapak/ Scotchpak袋中避光保存与偶合的PEG量呈反比见图1。蛋白质被PEG修饰后延由于PEG分子的反常泳动性以蛋白质的标记物作为迟了它在肾脏中的清除反过来又延长了它的循环半衰期。对照时 SDS-PAEG分析得到分子量要比实际的分子量要在以细胞为基础的体外活性检测时由于培养时间是固定高。为了避免这个问题可以采用PEG作为标记物同时进的PEG修饰后的生物分子半衰期的提高并不能得到显示。行针对PEG的凝胶特异性染色。在相对较短的培养时间内PEG修饰后的蛋白质与受体间的3.3分子量的测定和分析161亲和力较低导致活体外生物活性降低。质谱是确定不同种类PEG修饰蛋白分子量的一种较为理想的方法。新近研究岀的基质辅助激光解析飞行时间质谱方泫英文缩写 MALDI TOF MS不仅能够研究PEG修饰蛋白的分子量还能分辨出修饰蛋白的具体种类。3.4修饰位点和位置异构体的检澌1-1801020304050修饰位点和位置异构体的检测一般是各种技术综合分PEG相对分子质最/x103析的。这些技术包括离子交换液相色谱、分子排阻色谱、肽图、 Edman序列、氨基酸分析及 MALDT TOF MS。PEG图1体内、外生物活性与PEG摩尔质量的关系饰后的蛋白质分子可能出现的位置异构体可以用下列公式由未修饰的蛋白质、偶合了单个、二个、三个和更多PEG计算的蛋白质组成的混合物复配使用可能会更好。理论上修饰对于有N个位点可被修饰的蛋白质假定一次修饰κ度越高吸附速率越低延长了循环持续时间),受体的饱和个位点那么可能的位置异构体数目等于N!I(N-K)!度越低。由于吸附速率的不同而导致的上述混合物呈现重K!3迭生物活性见图2。3.5蛋白质的PEG修饰的指导原则19~20制备蛋白质的PEG修饰时应当考虑以下几点:①出发原籼蛋白质和PEG修饰剂〕的性质要了解清楚灣PEG修饰后的蛋白质是一种新型分子:它既不是蛋白质,也不是PEG而是两者的杂合物PEG修饰位点和化学计量关系应该确定④应保持制备过程的批次一致性修饰剂和修中国煤化工饰蛋白的制备应该通过认证CNMHG4修饰蛋白的生物学特性4.1生物活性21-2212耦合不同PEG数目(0,123个)蛋白质的体内生1977年, Abuchowski等231经实验证明,PEG修饰后的物活性重叠示意蛋白质作为药物比未修饰蛋白更有效迄今为止已有许多42药动学中国药学泰志chin Pharm J, 2002 June Vol, 37 No6.411将PEG修饰后的蛋白质注射到动物体内时呈现出比[10] Rameshraja P, Huashan W Anil G. Current aspects in pharmacol未经PEG修饰的蛋白质更好的药动学性质。由于血清循环gy of modified hemoglobin[ J]. Adv Drug Deliv Review 200:85半衰期和血浆保留时间都比未修饰的蛋白质高得多因而生[11]印春华张敏蛋白质和多肽类药物的PEG结合物物活性保持时间更长。新型给药系统J]中国药学杂志2001365)2924.3免疫原性12 J Zalipsky S, Menon-Rudolph S. Hydrazide derivatives of polyPEG修饰后的蛋白质的免疫原性会有显著地降低当(ethylene glycol and their conjugates[ A ]. In: Harris JM edl ethylene glycol )Chemistry Biotechnical and Biomedical饰度超过一定值时免疫原性会消失。Application M 1. 2nd ed. New York: Plenum press 1998:3194.4毒性341PEG修饰后蛋白质的毒性一般都比未修饰后的蛋白质13 Abuchowsky A Coy JR Palezuck CN et al. Alteration of immu-ical properties of bovine serum albumin by covalent attachment的毒性低。但是使用低分子量的PEG作为修饰剂时,修饰of poly ethylene glycol I J]. J Biol Chem 1997 2 3578蛋白有时还是存在一定毒性。静脉注射或肌內注射少量14 J Nathan A Zalipsky S, Kohn J Strategies for covalent attachmentof doxorubicin to poly( PEG-Lys ) a new water soluble polPEG时并未观察到毒性。只有长期和大量地使用PEG时(ether urethane I J ]. J Bioact Comp Pol,19949 239才有可能引发毒性。所以PEG修饰蛋白如细胞素、酶、荷尔[15] Habeeb AFSA. Determination of free amino groups in proteins by蒙一般不会呈现毒性。trinitrobenzensulphonic acid J]. Anal Biochem 1966, 14 328[16] Gotoh Y, Tsukada M Minoura N. Chemical modification of silkfibroin with cianuric chloride-activated poly ethylene gly-col经过PEG修饰的药物蛋白不仅较高地维持原药的生物analyses of reaction site by H-NMR spectroscopy and conforma-tion of the conjugate J ] Bioconjug Chem, 1993 A 554活性而且能够有效地降低或消除其免疫原性和毒性。同[17] Veronese FM Sacca B Schiavon O ,et al. PEG-Peptide and Pω-时由于分子量和交联度的增加修饰后的药物蛋白的循环半衰期显著延长。从而显示了药物蛋白的PEG修饰的良好的应用前景[18 Snyder SL ,Sobocinsky PZ. An improved 24 6-trinitroben-ne参考文献phonic acid method for the determination of amined[ J ]. Anal[1]周文孝袁庆辉聚乙二醇在生化药物化学修饰中的应用J1Biochem 1975 64 284中国药学杂志19973X3)13219 Bovara R Ottolina G Carea G ,et al. Modification of lipase from[2]毕爱华医学免疫学M]北京人民军医出版社,99593acryloyl morpholine and study ofts catalytic properties in orgamic solvents[ J ]. Biotechnol LettMatsushima A Hiroto M et al. Pegylation of protein[5/problems and solutiond J ] Biomaterials 2001 22# "iew w 20] Kozlowski A arris JM. Improvements in protein PEG ylatioand bioactive substances for medical and technical applicati[J]. Prog Polymer Sci 1998 23: 1233pegylation interferons for treatment of hepatitis a J].J Con Rel[4] Veronese FM. Peptide and protein PEG ylation: A re200l,7221721] Abuchowski A, Van ET, Palczuk NC, et al. Alteration ofPasacal B, Wolfgang B Polyethylene glycol-conjugated pharmamunological properties of bovine serum albumin by covalent attical protein J]. PSTT, 1998, 8)352tachment of polyethylene glycol[ J ]. Biol Chem,1977,252ith poly ethyl3578and other polymers. Altering properties of proteins to enhance [22 J Hershfield MS Biochemistry and immunology of poly( ethylenetic potentia[ J]. Adv Drug Deliv Rev, 1993, 10glycol ) Modified adenosine deaminase[ A ] In Harris JM . Zalipsky eds S-Pol( ethylene glycol ) Chemistry and Biological Ap-[7] Monfardini CS Branched monomethoxypoly( ethylene glycol )forplication( M ]. Washington: A merican Chemical Society 1998protein modification J ] Bioconj Chem 1995 622145~15[8] Veronese fm, Morpurgo M. Bioconjugation in pharmaceutical[23]洪民宋文俊聚乙二醇大分子化猪血红蛋白对其携氧特性的chemistr[J]. Inter J Phat影啊J]生物工程学报2000,(1)22.[9] Zalipsky S Chemistry of poly ethylene glycol )conjugates with 24 Farruggia B, Nerli B, Nuci HD et al. Thermal features of thebiologically active molecule J]. Adu Drug Deliv Rev 1995 16bovine serum albumin unfolding by polyethylene glycol! J]. Inter Biological Macromol .1999126 23收稿日期2001-01-18)医药信息裕隆世纪文化传播中心拥有庞大的医疗资讯数据库能够为您提供医药特别是生物医药全方位的信息咨询服务。内容包括药物研究发展动态信息国外有关生物制药公司产品、市场分析数中国煤化工研究报告医药产业发展分析报告医药研究成果资料知识产权信息包括医药产品专利信息CNMHG专项生物医药研究发展项目咨询服努包括项目论证、医药产品研究发展立项、市场调研等。联系电话(010)2117390}13641032621手机)朕系人杜云[本刊讯]万方揚m J, 2002 June, Vol. 37 No, 6中国药学杂志2002年6月第37卷第6期