丙烯腈对DNA交联作用研究

中国工业医学杂志2004年2月第17卷第1期 Chinese j Ind Med Feb2004,vol.17No丙烯腈对DNA交联作用研究崔金山,李海山,张淼2,张玉敏1,段志文1.沈阳医学院毒理学教研室,辽宁沈阳10∞034;2.沈阳市第四人民医院,辽宁沈阳10∞031)摘要:目的应用牛胸腺DNA和染毒丙烯腈(AN)小鼠精细胞研究AN对DNA的交联作用,研究AN毒作用的分子机制。方法应用溴化乙锭荧光法测定加或不加S条件下AN对牛胸腺DNA交联作用。雄性小鼠随机分为阴性对照,3、618和24mg/kgAN染毒组,毎组2只。腹腔注射染毒1次,于染毒第24h处死小鼠,分离精细胞观察细胞存活率,测定精细胞DNA交联率。结果加与不加S条件下,AN对牛胸腺DNA均未产生交联作用。小鼠精细胞DNA交联率在3、6、9mg/kgAN剂量范围内随剂量增加而升高,呈明确的剂量反应关系(r=0.935,P<0.05)结论在体外实验中AN对牛胸腺DNA未产生交联作用,对小鼠精细胞DNA在较低剂量时产生了交联作用高剂量产生断裂作用和交联作用。AN对精细胞的DNA交联作用可能是产生生殖毒作用的分子机制之关键词:小鼠;牛胸腺DNA;精细胞;DNA交联;丙烯腈中图分类号:R99;0623.76文献标识码:A文章编号:1002-221X(2004)1-0018-03Study on DNA cross-link effect of acrylonitrileCUI Jin-shan', LI Hai-shan', ZHANG Miao2, ZHANG Yu-min', DUAN Zhi-we(l. Department of Toxicology, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, China 2. Shenyang Municipal Fourth110031, China)Abstract: Objective To study the cross-link effect on DNa and the toxic mechanism of acrylonitrile( an) using calf thymus DNAand spermatids of AN exposed mice. Method DNA cross-link effect of AN in calf thymus with or without $9rescence assay. Male mice were randomly divided into control, 3my/kg, 6mg/kg, 9mg/kg, 12mg/kg, 18mg/kg and 24mg/kg ANgroups, two mice per group the mice were injected with AN ip and killed at 24 hours after treatment, separating spermatids and determining the survival rate and cross-link rate, Result There was no significant increase in DNA cross-link rate of calf thymus DNA exposedto AN with or without S9. Cross-link rates of spermatids in mice exposed to AN significantly increased with the dose in 3mg/kg, 6mgkg and 9 mg/kg groups, which showed significant dose-response relationship(r=0.935, P<0.05). Conclusion AN could not induce cross-link of calf thymus DNA in vitro, but could induce DNA cross-link of spermatids in lower dose and DNA cross-link combiningwith DNA strand-breaks of spermatids in higher dose in mice. The DNA cross-link effect on spermatids might be one of the molecularmechanisms of ANs reproductive toxicityKey words: Mice Calf thymus DNA Spermatid DNA cross-links Acrylonitrile丙烯腈( acrylonitrile,AN)主要用于制造腈纶纤丙烯腈购自上海试剂三厂,纯度≥95%,含氰氢维、ABS工程塑料及某些树脂材料,是人类广泛接触酸(以HCN计)0.05%,溶于水,临用现配。牛胸的职业性毒物和环境污染物12。动物实验和人群资腺DNA购自 Sigma公司,用Tis-EDA缓冲液配成3料均证明AN有生殖毒性和遗传毒性,AN可与睾丸mg/ml使用。溴化乙锭(EB)购自 Sigma公司,用磷精细胞DNA共价结合损伤DNA,致睾丸初级精母细酸盐缓冲液(20mmol/ L K,HPO4,0.4 mmol/L edta,胞染色体畸变率升高341,同时可使外周血有核细胞pH=12)配成10mg/L溶液线粒体DNA的缺失率升高5本研究以牛胸腺DNA1.2体外实验和染毒AN的小鼠精细胞为受试对象,探讨AN对将AN配成100、200、400800mmol/L水溶液DNA是否产生交联作用及其规律,为研究AN对机体以无菌水为阴性对照,以80mm/甲醛(FA)为的损伤作用提供分子机制。不加中国煤化工L马兜铃酸(AA)为材料与方法加S9CNMHG8方法,每管加入牛1.1试剂胸腺DNA与受试化学物各10l,再加入10l无菌水或S混合液,37℃水浴30min,每管加3mEB溶液发育在拙(则H+),男,我,主要研究方向为生殖和匀,应用HmF20荧光分光光度计测定稿日期:2003-07-28;修回日期:2003-09-08其荧光强度,激发波长525mm,发射波长590m中国工业医学杂志2004年2月第17卷第1期 Chinese J Ind Med Feb204,Vol.17No.1狭缝5m。置100℃水浴8min,迅速冷却至室温,测定结果再次测定荧光强度。从表1可见阳性对照物 FA DNA交联率为按公式计算交联率:C=[(∫-加)(1-加)×85.71%。各染毒组加热前后荧光强度与对照组比较100%经F检验差异无显著性(P>0.05式中:C为DNA交联率,f为经受试物处理管表1不加S时AN对牛胸腺DNA交联作用测定结果加热后荧光强度(EM2)与加热前荧光强度(EM1)(x±s,n=3)比值,所为阴性对照管FM2/EM比值。光热后荧光交联率强度EMEM’/EM(%)1.3体内实验阴性对照组65.87±3.4026.14±0.920.39861.3.1动物分组及处理选择健康性成熟的雄性昆l00mmo/LAN65.41±5.3126.48±1.70.4048明种小鼠,由沈阳医学院实验动物中心提供。随机分200mml/LAN64.02±1.7125.94±1.130.3958为3、6、9、12、18、24mg/kgAN染毒组和一个阴性400mAN64.12±2.5426.46±1.01041332.74对照组,每组2只小鼠,按0.1ml/l0g经腹腔注射800mml/LAN64.95±1.4425.97±0.520.39710.05次染毒,染毒第24h处死小鼠,分离精细胞800mLFA64.87±1.5759.32±1.471.3.2精细胞分离及存活率测定取双侧睾丸于2.3加s9时AN对牛胸腺DNA交联作用测定结果35mm平皿中,去除脂肪,加37℃预温的 D-Hanks液阳性对照物 AA DNA交联率为73.94%,说明冲洗2次〔每次5ml),再加5 ml hanks液,去除睾活性较好。各染毒组加热前后荧光强度与对照组比丸被膜,梳理并剪碎曲细精管,110目细胞筛轻轻过较,经F检验差异无显著性(P>0.05滤,1000r/min离心8~10min,弃上清,重悬细胞表2加S9时AN对牛胸腺DNA交联作用测定结果沉淀,台盼蓝染色,显微镜下计数细胞数并计算细胞存活率。将细胞原液浓度调至1.5×10个/ml。存活热前荧光加热后荧光EM’/EM1交联率(%)率达80%~90%以上的剂量组细胞,进行DNA交联性对照组512±0.7727.64±0.50.5率测定。100mLNN55,67±1.3428,30±1.100.50841.3.3精细胞DNA交联率测定取40μl细胞悬液0N5602.162.33±2.100.51733.17AN54.13±1,4827.69±1,O0加到200d溶解液(4mol/ L NaCl,50mml/L8moAN587±1.450.5101KH, PO4, 10 mmol/L EDTA, 0. 1% Sarkosyl FA 2 g/L 10mmoV/L AA 55.40+1.36 48.20+1.390.8708RNase)中,37℃水浴16h,加入500U/ml肝素溶24AN对小鼠精细胞DNA交联作用测定结果液,37℃水浴20min。测定及计算DNA交联率同体从表3可见,在3、6、9mg/kg范围内随染毒AN外实验。每只小鼠测2个平行样剂量增加小鼠精细胞DNA交联率升高,呈现明确的1.4统计方法剂量反应关系,其相关系数r=0.9349,P<0.05应用SPs软件进行数据分析,荧光强度以x±ξ剂量达12mg/kg时,加热前荧光强度明显低于阴性表示,各组间差异比较采用F检验,并进行直线相对照组(P<0.05),而其他各组与阴性对照组加热关分析前荧光强度差异不显著(P>0.05),12mg/kg组加2结果热后荧光强度高于阴性对照组,但明显低于其他剂量2.1精细胞存活率组,且交联率仍高达60.76%。加热后荧光强度各染分离的精细胞在高倍镜下可见细胞呈圆形,形态毒组均高于阴性对照组(P<0.05均一,分散良好。从每只小鼠可获得(1~1.5)表3AN对小鼠精细胞DNA交联作用测定结果10个精细胞。经台盼蓝染色计数存活率,阴性对照(x±s,n=4)组及3、6、9、12、18和24mg/kgAN组细胞存活率中国煤化工光EM/EM交联率依次为99%、%6%、94%、91%、80%、65%和阴性对CNMH根据体外细胞毒性实验一般要求细胞存活率应3mg/kgAN29.68±3.1015.52±0.850.506025.21控制在80%~90%的原则,确定小鼠精细胞DNA交6ng/kgAN29.85±1.2324.10±0.250.785669.579 ng/kg AN29.14±2.1025.21±0.31联实验剂量为3、6、9和12mg/kgAN。mg/kgAN17.97±10.74022不加系统时N对牛胸腺DNA交联作用经F检验,与阴性对照组比较*P<0.05,**P<0.01中国工业医学杂志2004年2月第17卷第1期 Chinese j Ind Med Feb2004,vol.17No3讨论代谢转化为活性中间产物2-氰环氧乙烷(CEO),AN溴化乙锭与双链DNA结合可产生荧光,而DNA与CEO均具有亲电性,而CEO比NN更强,二者均在加热变性为单链后荧光衰减,交联DNA由于解链可损伤生物膜,产生活性氧攻击DNA大分子,造成受阻荧光衰减幅度小8牛胸腺DNA交联实验是检DNA损伤1341,在外周血和睾丸组织中AN和CEO测外来化学物对DNA损伤的一种简便、快速、可靠均可通过直接脱烷基作用烷化DNA,与DNA共价结的方法。本研究发现AN在100~800mmo/L范围合形成加合物,使DNA断裂和/或交联,使基因突变内,无论加与不加S代谢活化系统,AN均未对牛胸产生遗传毒作用4590。本研究结果进一步证实AN腺DNA产生交联作用。但在同样条件下不加S9的及其代谢产物可使精细胞DNA产生交联作用,较大800mmo/L甲醛和加S的10mmoL马兜铃酸均对剂量产生DNA断裂,因而进一步证明AN所致生精细牛胸腺DNA产生了明显的交联作用,说明本实验方胞DNA损伤是产生生殖毒作用的分子机制之法可靠,S活性较好,未产生假阴性,结果可信。参考文献有报道体内实验AN对大鼠外周血淋巴细胞DNA产生[1]张贵利,戴修道,丙烯腈毒作用研究进展[J]中国公共卫生学损伤作用9,目前尚未见AN体外DNA交联实验报报,1998,17(3):1921告。AN作业工人外周血有核细胞线粒体DNA在较低[21崔金山,杨凯,付守林,等,丙绵周对雄性小鼠生殖功能影响研究[J]工业卫生与职业病,2001,27(3):155-158剂量产生了交联作用3本研究AN对牛胸腺DNA未[]吴鑫,钟先,丙烯腊生殖毒性研究概况[J1芳动医学,2000产生交联作用,推测可能是牛胸腺DNA对N损伤较17(1):51-52其他组织不敏感,或AN代谢活化要求的酶系仅S9[4] Ahmed ae,Akds, Nour am.A是不够的,因此在体外未能转化为活性中间产物损伤DNA in rats [J]. J Biochem Toxicol, 1992,7(1): 5-6DNA,而致检测结果为阴性。[5]丁晟,马来记,范卫,等.丙烯腈作业工人外周血有核细胞线体DNA损伤研究[J].中华劳动卫生与职业病杂志,2003,21体内染毒AN分离精细胞的DNA交联实验发现(2):99-101染毒剂量在369mg/kg范围内精细胞DNA交联率〖6]李海山.马兜铃酸的肾毒性及DA损伤机制研究[D]大连医随染毒剂量增加而升高,呈现明确的剂量-反应关系科大学硕士学位论文.2003,P16说明AN及其代谢产物在该剂量范围内对精细胞DNA[7]杨丹风,袭著革,张华山,等.3种醛类化合物对DNA的交联生产生了明显的交联作用。当剂量达12mg/kg时由于成作用[J].中国公共卫生学报,199,18(2):110-111剂量增加对精细胞毒作用加强使精细胞死亡率达[8]黄建鸣,董玉宁,许峰,等.EB荧光分析法测定肿瘤细胞DNA交联与增殖活性[J]生物化学与生物物理进展,196,23(1):20%由于细胞死亡致使DNA碎裂和断裂不能与溴化乙锭产生荧光使加热前荧光强度明显低于对照组,[9张正东,刘丰,金复生,等.丙烯腈对大鼠外周血淋巴细胞DNA交联率低于6mgkg组可能在该剂量下AN对生精细损伤研究[J]劳动医学,1999,16(4):220-22胞DNA既产生了断裂作用又产生了交联作用。10] Ban F, LocndavistJ, boyd R, et al. Theoeritcal studies of the cross-AN在体内经细胞色素P450酶系的亚族CYP2E1linking mechanisms between cytosine [J ]. J Am Chem Soc, 2002, 124(1):2753-2761个单牛木单单中代单中中单产单中单个单个单水单个单单单中个单牛单个单单单单中大单中个单中单中个单中十十〔上接第17页)本实验结果表明在温石棉与AM开起的氧化损伤。始孵育时激活了体內的抗氧化系统,但随着孵育时间参考文献的延长,体內抗氧化酶耗竭,岀现了下降的趋势。说「1 Kamp W D, Weitzman sa· The molecular basis of asbestos induced lung明温石棉能破坏AM的自我防御系统。injury [J]. Thorax, 1999, 54: 638-652Onom是从可食用植物中提取的天然活性物质,[21王起恩,樊晶光,张使,等,吸烟与温石梯单推及联合作用对人含有黄酮、多酚、花色素、皂角苷和其他天然植物成胚肺细胞DNA链断裂的影响[J]中华劳动卫生职业病杂志分,功能试验证实它具有sOn活性,可以直接清除3]wa中国煤化工al. The interaction between asO。对石英粉尘所致肺泡巨噬细胞的氧化损伤有CN MH Gof rats pleural mesothelial cells定的缓解作用4本研究表明 OncolⅦm可以降低温石culture [J]. Am J Pathol, 1987, 126: 343-349棉引起的MDNA断裂,提高抗氧化酶SOD和GH.[4]刘英莉,张艳淑,ArH.kDag等. Oncolyn对石英粉尘所致肺泡巨噬细胞某些生化指标的缓解作用[J].中国职业医学的活性。在温石棉与肺泡巨噬细胞作用的同时分2003,30(2):30-31别加入不恬浓的 Oncol,可以部分预防温石棉引