RP-HPLC法测定发酵液中β-苯乙醇的研究

食…分桁检测Science and Technology of Food IndustryRP-HPLc法测定发前液中β-苯乙醇的研究刘东亚,金征宇(江南大学食品学院,江苏无锡214036)饔:运用反相高效液相色谱对发酵液中的β-苹乙醇进行定1材料与方法性定量分析确定了RP-HPLC测定发酵液中β-苯乙醇1.1材料与仪器的含量的方法。色谱柱: Dikma Diamonsil C1(150m46mm,5μm, Waters),流动相:甲醇:水=40:60(w/),流速B-苯乙醇标准品 sigma;L-举丙氨酸1.0mL/min,紫外检测波长:260nm,拄温:30℃,外标法定色结果:RP-HPLC法测定浓度在420L/10m时线级,江苏无锡晶海氨基酸股份有限公司;甲醇性关系良好,r=0998,平均加样回收率为叨71%,RSD纯,江苏汉邦科技有限公司;超纯水自制。为1.04%(n=5)。此方法准确,灵敏,简单,重现性好,适合于发酵液这种复杂体系中β一萃乙醇的定量分析。UV-1201紫外可见分光光度计北京瑞利分析美镳调:β-苯乙醉,发酵液,反相高效液相色谱法仪器公司; Agilent Il00高效液相色谱仪系列包括中图分类号:TS201.1文献标识码:A四元泵、DAD检测器、自动进样器和色谱工作站;电文章编号:1002-0306(2006)01-0198-03子天平 METTLER TOLEDO,AB104- N MAXIO1g,d=0.lmg;045m微孔滤膜上海兴亚净化材料厂台式离心机TD-5上海安亭科学仪器厂。B-苯∠醉(B-PE)足一种有着浓郁的玫塊香味12实验方法的醇,玫瑰香料的广泛需求使得B-PE成为香料和化1.2.1色谱分析条件色谱柱: Dikma Diamonsil CI妆品行业中使用量最多的香味成分。天然β-PE存在(150mm×4.6mm,5μm, Waters);流动相:甲醇:水于很多花和植物,如玫瑰、风信子、某莉、水仙、百合(40:60/v);流速:lm/min;柱温:30℃;进样量等的精油中,玫瑰精油中β-PE的含量较高,最高可达60%,向浓度的产品只有用溶剂抽提才可生产出10uL;检测波长:260nm。122溶液的制备来,但损失很大,提取价格昂赀。欧美食品立法机构把用物理法、酶法或是微生物法处理自然资源生产122.1标准品溶液精确量取01mLB-苯乙醇标出来的香味成分定义为天然香料。酵母的 Ehrlich代准品,用甲醇溶解,定容至10mL,配成浓度为谢途径屮,通过把L-举丙氨酸生物转化为2-PE是100μL/10mL的贮备液,分别吸取贮备液0.0、0.40.8、1.2、1.6、20mL以甲醇定容至10mL,得0、4、8种很好的生产天然阝-苯乙醇的方法。在β-苯乙醇产生菌的菌种选育和发酵工艺研究过程屮,需要建立12、16、20μL10mL的标准液,经045μm微孔滤膜过种对阝-苯乙醇组分和含量的快速检测方法。日滤后,滤液用于HPIC测定1.2.2.2发酵液样品溶液苯乙醇发酵液以前,已报道的检测方法有GC法、HPLC法,国内该方4000r/min离心15min,去除菌体,取上清液用面研究目前尚无相关报道。本文利用反相高效液相045μm过滤,即得待测样品溶液。色谱法对发酵液中β-苯乙醇的定量测定进行了研检测波长的确定将β-苯乙醇标准品溶解于究,狄得了较为满意的结果可作为β-苯乙醇的定量甲醇中,制备成浓度约20μL/10mL的溶液,在200-测定方法。400mm的波长范围进行紫外光全波扫描,β-苯乙醇在218、260m有2个紫外吸收峰,实验中以218nm收稿日期:2005-03-12为检测波长时干扰较大,260mm时色谱图基线平稳作者简介;刘东亚(1981-),男,在读硕士研究生,研究方向:生物技术在食品中的应用。峰形良好,故选择260mm作为檢测波长食品业钟核分析检测ol.27,No.O1,2006好,如表1所示(n=5)。1.27回收率实验取已知β-PE含量的发酵液315份,向其中分别加入三个浓度水平的B-PE标样,测定加入标样后的回收率,算得平均加样回收率为9771%,符合测试要求,如表2所示。01.2.8发酵液样品测定12.8.1发酵液的预处理β-PE发酵液以4000r/mi波长(m)离心15min,去除菌体,取上清液用0.45μm过滤,即图1得待测样品溶液。124流动相和流速的确定文献中采用乙腈-水以1.28.2标样及样品的分离色谱图在上述优化的相关配比作为流动相。考虑到乙腈价格较高,同时参色谱条件下,标准品和样品溶液得到充分的洗脱和考其他文献,分别配制不同组成的流动相进行实验,分离,保留时间分别为7207和7220min,色谱图见经过多次筛选,结果表明,甲醇-水(40:60,vv的系统图3、图4。从图中可知,在本色谱条件下,发酵液中效果最好。同时,对不同流速(080、100、120ml/min)条的β-PE能得到很好的分离,保留时间与标准品基本件下的分离情况进行研究。与1.00 ml min相比较,流致,峰形对称且无明显的干扰峰。速为080mL/min时保留时间增加,分离效果较差;流速为L20ml/min时保留时间缩短,但不明显,且分离效果与100mL/min相差不大。考虑到柱压的因素,最终选用流速为100mmin。1.25标准曲线的绘制按2.2中所配048、1216、20μL/lOmL的标准液,经0.45μm微孔滤膜过滤后,在上述优化的色谱条件下进样10μL测定,以浓度50为横坐标,峰面积为纵坐标作标准曲线,结果见图2。02,。,线性回归方程为y=23902x-13188,r=0.9998。结果表明,B-苯乙醇在4-20μL/10m范围内线性关系良好。图3标准品色谱图60004000标样浓度(μL/1OmL)0图2β-苯乙醇标准曲线57.510125126精密度实验取…浓度128mL/左右的发酵液样品,在前述色谱条件下连续进样5次,考察方图4发酵液样品色谱图法的重现性。算得柑对标准偏差为104%,精密度良1.2.8.3发酵样品测定结果如表3表1精密度实验(n=5)测定值mL纽分平均值m/1)RsD)%B-P530741.2845126631,277612838表2加样回收率实验原样浓度(mL)添加浓度(mL)测定浓度(mL/)问收率%)平均回收率(%)0.40097270.8002.01997.71.60029170L.17食业技分析检测Science and Technology of Food Industry表3发酵样品测定结果中的岚味强化肽食品与发酵工业2004,30(90:96-995]赵光辉,王成福李俊萍采用反相高效液相色谱法测定木测定结果(mLD0.80.720.36119094糖醇产品中各组分含量食品与发酵工业,2004,30(7:1172讨论[6 MM W Etschmann, D SelJ Schrader. Biotechnological本文建立了一种HP-HPLC法测定发酵液中B- production of2- phenylethane. Appl Microbiol BiotechnolPE的分析方法,流动相为甲醇:水(40:60,v/v);色谱柱2002.59:1-8%3 Dikma Diamonsil C:(150mm x4.6mm, 5um, Waters), [71 Christoph wittmann, Michael Hans, wilfried Bluemke流速1ml/min,最适吸收波长260mm。此方法具有处 Metabolic physiology of aroma -producing Kluyveromyces理简单、快速、定量准确、回收率高和重复性好的特 marxianus[J Yeast,200.191351-1363点。在B-PE产生菌的菌种选育和发酵工艺研究中采8] Chung- Jr Huang Shiow- Ling lee, Cheng- Chun Chou用本法,可有效的对菌株生产能力和发酵条件进行 Production of2- phenylethanol, a flavor ingredient. by Pichia评价,为菌株改良,发酵与分离工艺的优化,提高单fermentens L-5 under various culture conditions. Food位发酵液的目标产率和分离提取的收率提供了有效 Research International.20134277-282的分析分离手段9) D Stark, T Munch, B Sonnleitner, I W Marison, U von参考文献Phenylalanine by Saccharomyces cererisiae [] Biotechnol Prog[]达世禄色谱学导论M武昌:武汉大学出版社,1999320-3392002,18:514~523.[2]孙宝国,等香科与香精M北京:中国石化出版社20009-10[10] MM W. Etschmann, n Sell, J Schrader. 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