聚乙二醇对不同浓度肺表面活性物质活性的影响

中国小儿急救医学2007年8月第14卷第4期Chun Pedatr Emerg Med, Aug 2007 Vol 14, No4●317●聚乙二醇对不同浓度肺表面活性物质活性的影响孙丽萍甘小庄董声焕宋国维郭琳瑛王翀李红日[摘要]目的观察非离子聚合物聚乙二醇(PEG)对不同浓度肺表面活性物质(PS)活性的影响。方法(1) 体外实验:利用团泡式表面张力仪测证PEG、不同浓度PS(Curosurf)、血浆及混合物的最大表面张力(Ymax)和最小表面张力(rmin),并计算其稳定系数(S.1.)。(2) 体内实验:大鼠经气管滴入3 mg/ml的3X 109 CFU/ml大肠杆菌, 24~36 h后,对大鼠行气管插管并左侧颈动脉插管术，机械通( 15 mn。然后将Pa02≤26.6 kPa的大鼠随机分为三组,经气管分别滴入2 ml/kg生理盐水(NS组)，Curosurf(PS 组) Curosurf与5% PEG混合物(1/2PS+ PEG组)。另设正常对照组(不给细菌)。大鼠机械通气180 min后，用生理盐水[20 m/(kg'次)]灌洗大鼠右肺三次，测定灌洗液的ymin。结果(1) 体外实验:1.25 mg/ml的PS ymun<2 mN/m,S. 1.>1.6,而0.62 mg/ml和0.31 mg/ml的PS Ymun >10 mN/m,S.1. <0.8;加入5% PEG后，混合物ymn<2 mN/m,S.1.>1.6;血浆存在时，不同浓度PS与PEG混合物不同程度地降低了rmin, 提高了S.1.存在1%血浆时.1.25.0.62 mg/ml PS与PEG混合物ymun<2 mN/m,S.1.>1.6,并且组间差异无显著性(P>0.05)。(2) 体内实验:1/2PS+ PEG组和PS组大鼠肺泡灌洗液rmun与正常对照组比较差异无显著性(P>0.05),与NS组比较显著降低,差异有显著性(P <0.05);组间比较差异无显著性(P>0.05)。结论PEG可以在一 定 程度上提高不同浓度PS的活性，逆转因血浆蛋白引起的失活。[关键词]聚乙二醇 ;肺表面活性物质;表面张力;稳定系数The effect of polyethylene glycol on activation of different concentrations of pulmonary surfactant SUNLx ping, GAN Xrao zhuang, DONG Sheng-huan, et al. Caprtal Insttute of Pedatrcs, Beyrng 100020,China .[Abstract] Objective To investgate the effect of polyethylene glycol(PEG) on activation of dufferentconcentrations of pulmonary surfactant(PS). Methods (1) In vitro expenment; The maximum( yYmax) andminmum surface tension(ymun) of PEG, dufferent concentrations of PS(Curosurf), plasma and ther muxtureswere measured by captive bubble surfactometer, respectively. Values of stabulty index(S. I.) were also calcu-lated. (2) In vivo expernment: Rats recerved a dose(3 ml/kg, 3X 10"CFU/ ml) of E. coli via the arways. After24~ 36 h, the anumals were ventlated for 15 min and treated vna the tracheal cannula wth 2 ml/kg salne(NSgroup), Curosurf(PS group) or a muxture of Curosurf and 5% PEG(1/2 PS + PEG group) when PaO2≤26.6 kPa. Control animals were not recerved bacterna. After 180 min ventlation wnth 100% O2. anumals weresacnfnced. The nght lungs were washed for three times wth salne[20 ml/ (kg* tume)]. The lung lavage fluidwas centrifuged and measured. Results (1) In ntro:The rmin of 1.25 mg/ml PS was <2 mN/m and S. I.> 1.6. The Ymin of 0.62 and 0.31 mg/ml PS was > 10 mN/m and S.1. <0.8. When 5% PEG ad ded, yminwas <2 mN/m and S.I. >1.6 PEG significanly enhanced the abulty of curosurf n reducing the Ymin andelevatingS. 1.in the presence of plasma. (2) In vivo: There were no significant dfference in yrmin of lunglavage flud between PS, 1/2PS + PEG, and control group; The Ymun values in PS and 1/2PS+ PEG groupwere less than that of NS group(P <0.05), and there were no signficant dfference between PS and 1/2PS+PEG group. Concusion PEG enbanced the ablty of dfferent concentrations of PS to reduce surface tentionand reversed the inactivaton of PS induced by plasma.[Key words] Polyethylene glyol; Pulmonary surfactant;Surface tension; Stablty index肺表面活性物质(PS)治疗新生儿呼吸窘迫综性的影响。合征(RDS)取得了良好效果,而对急性肺损伤1 材料和方法(ALI)及呼吸窘迫综合征(ARDS)的治疗效果仍不1.1实验 动物健康Sprague-Dawley(SD)雄性理想。因为ALI及ARDS的主要病理改变之一是大鼠,220~240g,维通利华实验动物技术有限公肺毛细血管通透性增高,大量的血浆蛋白滲出到司提供。肺泡,抑制了PS的功能”。本实验的目的是观察1.2实验试剂固尔苏(Curosurf)为意大利非离子聚合物聚乙二醇(PEG)对不同浓度PS活Chies"中提取的天然PS制剂:TYH中国煤化工悬液。冰冻人血浆由CNMHGt,蛋白质含量大基金项目:北京市自然科学基金资助项目(7042018)于50 g/L,其中白蛋白64.4%,球蛋白23.0%,纤.作者单位7100020,首都儿科研兖所通讯作者:甘小庄, E-mal: ganxz@ hotmal. com维蛋白原1.68 g/L。PEG 分子量10 000,为Sigma●318●中国小儿色数医学2007年8月第14卷第4期_ Chin Peduatr Emerg Med, Aug 2007, Yol 14, No 4公司产品。大肠杆菌(011B4 E. coli)由中国药品生分析(ANOVA),两组间均数比较,方差齐时用S物制品检定所提供。N-K法检验,方差不齐用Games-howell法检验, P1.3 实验仪器 CB-I型闭泡式表面张力仪在可<0.05为差异有显著性。控闭泡式表面张力仪基础上有所改进[2],由北京2结果分析仪器研究所与首都儿科研究所联合研制。2.1体外实验560E振荡器为美国科学工业联合公司产品。低温2.1.1不同制剂γmin和S.I.测定结果生理盐离心机为德国Eppendorf 5804R。SC-Y200 呼吸机水、PEG、血浆及混合物γmin均大于10mN/m,为上海医疗器械四厂产品。S.I.小于0.8,都不具有PS的活性，见表1。1.4实验方法表1生理盐水 、PEG及血浆混合物ymn和s.1.间的比较(x士s)1.4.1体外实验1.4.1.1待测液体配制生理 盐水溶解PEG,使PEG与血浆混合物Ymun(mN/m)s 1.生理盐水28.9710.750.36+0.03其浓度为5%。冰冻人血浆在37 C水浴中融化5% PEG28.08土1 110.27+0.03后,加到5%的PEG溶液中,使其终浓度为1%或1%血浆34.15+0.490.27士0.012%。Curosurf(80 mg/ml)用生理盐水稀释,浓度2%血浆31.89土1.760.29 +0.04分别为1.25.0.62、0.31 mg/ml,振荡混匀,现用现5%PEG+ 1%血浆29.68+1.110.36士0.05配。5% PEG+ 2%血浆27.41+1 690.39+0 061.4.1.2表面张力测定在安装密封环的5 ml2.1.2 PEG 对不同浓度PS与血浆混合物的影响玻璃注射器的顶部制成一一个1%的琼脂糖支撑面，1.25 mg/ml的PS ymin <2 mN/m,S.1.>1.6;下面装有待测液体。用微量注射器将30μl空气.0.62 mg/ml和0.31 mg/ml的PS ymin> 10 mN/m,注入待测液体,使形成的气泡在琼脂糖底部正S.I. <0.8;加入5% PEG后,混合物rmin<2 mN/中2]。注射器固定在37 c恒温水槽的支架上。.m,S.1.>1.6。即使存在血浆时, PEG与不同浓度常压下在读数显微镜下测量气泡的高度及横径,PS混合,仍能不同程度地降低ymin,提高S.1.。见测得最大表面张力( ymax)。通过稳压阀给气系统表2,3。加压至150 kPa,用拉杆(三通阀)排气,稳定在加表2不同浓度Cunourf与PEG及压状态，再测量气泡的高度及横径,测得最小表面血浆混合物yrman的比较(土s,mN/m)张力(ymin)。一般PS的rmin应小于10毫牛顿/PEG与血浆Curour(mg/ml)米(mN/m)。稳定系数(S. I.)=2 x (Ymax -混合物.1.250.620.31γmin)/(ymax+ γmin),正常在0.8以上。1.54+0.03 21.78+1.69" 21.85+1.78*1.4.2体内实验大鼠气管滴入3 m/kg的3x5%PEG1.37+0.12 0.85 土0.06*0.83 +0.08*109 CFU/ ml的大肠杆菌(E. coli),24~36h后,对18.98士0.46 23.55+1.12* 25.28+2 24*#大鼠行气管插管并左侧颈动脉插管术,机械通气22.94+0.42 28.47+2.48* 32.75t3 83*5%PEC+1%血浆1.59土0.221.68士0.156.18士0.38* #[频率50次/ min;吸气时间0.55 s;吸气时间/呼气5%PEG+2%血浆1 43土024 4 84土0 35°_ 19 24土0.96*#时间1:1.2;呼气末正压4~6 cm H2O(1 cm H2O=注:与1.25 mg/ml Curosur组比较，. P<0.0S;与0.62 mg/ml0.098 kPa);氧流量8 L/min;潮气量8~ 10 ml/Curosurf组比较，#p<0.05。kg]。15 min后，PaO2≤26.6 kPa的大鼠随机分为表3不同浓度 Curosurf与PEG及三组:经气管分别滴入2ml/kg的生理盐水(NS血浆混合物s.1.间的比较(压土s)组)、Curosurf (160 mg/kg, PS组)及CurosurfCuroeurf(mg/ml)(80 mg/kg)与5% PEG混合物(1/2PS+ PEG组)。混合物另有一组动物不给细菌,为正常对照组。分别机1.71+0.01 0.44士0.08* 0.47 +0.07*械通气180min后,颈动脉放血处死大鼠,原位结1.76+0.02 1.85士0.01* 1.85 t0.01*扎左侧支气管,生理盐水用量20ml/(kg*次),经气0.38士0.05 0.3610.05 0.33 +0.13管插管灌洗右肺3次,每次重复3遍,收集灌洗液，0.34士0.02 0.40+0.08 0.31 40.085%F中国煤化工031.15+0.06**回收率> 85%,4 C离心(3000转/min) 10 min,上5%P0S° 0.17+0 04*清液用于表面张力的测量。MHc N M H Go0.05;与0.62mg/m1.5统计方法实验数据以均值士 标准差.Curosurf组比较，#P<0.05.(G土s)表示,采用SPSS 12.0统计软件进行方差2.2体内实验1/2PS+ PEG组和Ps组大鼠肺泡中国小儿急救医学2007年8月第14卷第4期Chn Pedatr Emer Med, Aug 2007 Vol 14.No 4灌洗液ymin与正常对照组比较,差异无显著性同浓度的Curosurf都失活;当加入PEG时,又不同(P>0.05),与NS组比较显著降低; 1/2PS+ PEG程度地提高了它们的活性。这和国外学者[8-10]报组与PS组间差异无显著性(P>0.05),见表4。道的非离子聚合物(PEG、葡聚糖)可以逆转PS因表4各组间大鼠肺 泡濮洗液最小表面张力的比较(丘士s)血浆、胎粪等引起的失活,提高了Survanta(从牛肺组别数量(只) .组织提取的PS)降低肺泡表面张力的能力是- -致正常对照组24.38士1.73的。NS组36.68士8.23*我们应用大肠杆菌制造了ALI动物模型,因Ps组26.88土1.87*肺毛细血管通透性增高,大量的血浆蛋白渗出,抑1/2PS+ PEG组25.25+4 12#注;与正常对照组比较, 'P<0.0S;与NS组比较, "p<0.05.制了PS活性。实验结果表明，1/2PS+ PEG组和PS组大鼠肺泡灌洗液的γmin与正常对照组没有3讨论3.1 闭泡式表面张力仪的应用 表面张力测定显著差异;与NS组比较,显著降低。这说明在半是了解肺PS物理性能的重要手段。表面天平被量PS中加入PEG,增强了低浓度PS降低肺泡表称作经典的表面张力仪,但它操作复杂,测定温度面张力的能力。总之,我们的实验结果提示，在PS中加入一不易控制,需要标本量大,标本自动渗漏,因此它定量的高分子聚合物可以在- -定程度上提高不同的使用受到限制。搏动泡式表面张力仪,根据浓度PS的活性,逆转PS因血浆蛋白引起的失活，Laplace定律的原理设计,此法操作简单,测量温度为研制新型PS提供了实验依据。容易控制,需要标本量小,但也有样品渗漏的问题。闭泡式表面张力仪是20世纪80年代末开始参考文献应用的新型表面张力测量装置[4,5]。可封闭气泡[1] Lews JF, Veldhwzen R. The tole of exogenous sufacant mn the的注射器是该仪器的关键部分,悬于凝胶下的小.treatment of acute lung mjury[J]. Annu Rev Physol, 2003, 65气泡周围都被待测液体包围,避免了可能的扩散2]邓渊,董声焕,张广安，等.可控闭泡式表面张力测定仪的研(6):613-642.和稀释。我们使用的仪器是在国外经验基础上研制[J].中国医疗器帔杂志1994, 18(2):87-89.制的,其最大优点是密闭的小泡完全避免了待测[3]董声焕呼吸衰竭基础与临床[M].北京:人民军医出版社,液体的滲漏,小泡压缩后可以很快达到平衡,而且1992:41-42测量时需要的样品也较少,结构简单,使用方便,[4] Schurch s, Bacholen H, Goerke J, et al. A captve bubble methodreproduces the in stu behavnor of lung surfectant monolayers并且经实验证明准确度和精密度良好。[].J Appl Pbysol, 1989, 67(6) :2389 2396.3.2 PEG 对PS失活的逆转作用PS 具有降低[5] Scburch s, Bacholen H, Goerke J, et al. Surface propertesof rat肺泡表面张力,防止肺泡萎陷,维持肺脏正常生理pulmonary surfactant studued wnth the captive bubble motbed;adsorpton, hysteres, sabhty[J]. Brochum Biopbys Acta, 1992,功能的作用。ALI及ARDS动物模型和临床资料1103(1):127-136. .提示，ALI及ARDS时肺组织毛细血管通透性增[6] Frerkang 1, Gunther A. Seeger w, et al. Pulmonary surfastant:加，血浆蛋白渗漏到肺泡,抑制PS的活性,成为functons abnormaltues and therapeuthc options [J]. IntensiveCare Med, 2001, 2711)1699-1717.PS功能异常的-一个重要原因6。Zasadzinski 等[7][7 ] Zassdznsla JA, Ahg TF, Alonso C, et al, Inhabrtion of pulmonary和我们以前的实验都发现,PS和血浆蛋白等抑制surlactant adsorpton by serum and the mechansms of reversal物存在竞争性抑制,当存在较高浓度血浆蛋白时,by hydrophle polymers: theory[]. Brophys J, 2005, 89(3);1621-1629.就需要高浓度的PS对抗它的抑制。因此,胎粪吸[ 8] Willam Taeusch H, Lu KW. Goerke J, et al. Nononuc polymers入综合征和重症肺炎等疾病患儿需要高浓度的PSreverse inactvation of suractant by meconum and other sub-治疗才有效果。但是, PS的价格昂贵,有必要研制stances[J]. Am J Respur Cnt Care Med, 999, 159(5 Pt 1);1391-1395.能够更好对抗血浆蛋白抑制的新型PS。[9 ] Tashuro K, Kobayashu T, Robertson B. Dextran reduces surfac--般PS的γrmin应小于10mN/m,s.I.大于tant mhubton by meconum[]. Acta Padatr, 2000, 89(12):0.8。本实验结果显示, 1.25 mg/ml的PS ymin小1439-1445.于2 mN/m, s. I.大于1.6,具有降低表面张力的活[10] Lu Kw, Coerke J. Clemment JA, et al. Hyaluronan Decreases性;而0.62 mg/ml和0.31 mg/ ml的PS γmin大于中国煤化工咖Re 205,57(2);210 mN/m, S.1.小于0.8,不具有活性;当加入PEGTHC N M H G回日期:207.0420)时显著降低了yrmin, 提高了S.1. ;存在血浆时,不(本文编辑:李巍)