反义核酸技术及应用

第25卷第4期大连医科大学学报2003年12月Journal of Dalian Medical University反义核酸技术及应用曹长姝,隋鸿锦大连医科大学解剖学教研室辽宁大连116027)关键词扳义核酸技术;反义寡核苷酸P2-2010中图分类号夏52文献标识码文章编号:1671-72932003)4-0300-03反义核酸技术是用人工合成的或生物合成的特定互补合成的反义寡核苷酸抑制真核细胞基因、癌基因、病毒基因的DNA或RNA片段阻断从基因到蛋白的信息流,以达到及其他內源基因的表达其已经成为一种重要的抗肿瘤、抗抑制或阻断基因表达的生物新技术。利用核酸分子杂交原病毒侯选药物并进行了大量的体外、体内研究。理将反义寡核苷酸( antisense oligonucleotide ASON胙作为外源性基因表达抑制物结合到靶mRNA序列上阻止其翻译成2反义核酸技术的作用机制蛋白1。具有杂交特异性和选择性调节基因的表达的特在反义核酸技术的应用过程中由于多种化学修饰的反点21这一技术不仅已成为常用的实验室研究方法还广泛义寡核苷酸的出现其作用机制已不仅仅是诱导 RNaseh的的应用于研究病毒、肿瘤、寄生虫和遗传性疾病的预防和治切割机制RNεseH是一种广泛存在旳酶在病毒和人体细胞疗具有重要的应用前景。中都有发现能降解 DNA/RNA复合物中的RNA链)还存对于人类基因的研究,人们采用分子克隆、分子杂交、在于非 RNaseh依赖的切割机制:如双链 RNase、 RNasel、PCR技术等一系列研究手段。DNA重组技术的问世推动 RAsp合成的切割物以及核( ribozyme)而且可以通过了一个新的研究领域的发展3。反义核酸技术从反向遗传非切割机制阻碍mRNA的代谢如5′帽加工、调节剪接、抑学的角度为分子生物学增添了新的内容。所谓反义核酸技制翻译起始、抑制翻译延长破坏核酸的相互作用5。术是一种根据碱基互补原则用人工合成或生物合成的与特所以在设计ASON时不仅要考虑它的序列特异性还要定的基因互补的DNA或RNA片段或其化学修饰物)断考虑它的作用机制而且对一个特定的ASON其反义活性可从基因到蛋白的信息流从而达到抑制或阻断基因表达的技能涉及多种机伟术。反义寡核苷酸是一类人工合成或构建的重组载体表达的寡核苷酸片段通过碱基互补的原理干扰基因的解旋、复3反义核酸技术中寡核苷酸的序列设计、摄取及转运制、转录、mRNA的剪接加工、翻译等各个环节从而调节细从目前的研究来看反义寡核苷酸的设计应考虑到其在胞的生长、分化等。体内的稳定性、能容易地进入细胞并与靶序列高亲合性结合反义核酸技术的发生发展且不产毒性与靶序列结合后特异性抑制靶基因地表达。所以选择反义DNA或反义RNA时,为使之特异地结合mR1977年 Paterson发现外源性核苷酸可调节基因表达,NA上,般至少15个核苷酸最长不超过20~25个太长1978年 zamecnik等证明特异互补的寡核苷酸在体外能有效的反义核苷酸很难进入细胞内,一般选用18个核苷酸左右的扣制Rous肉瘤病毒RSv增殖。80年代早期人们发现细为宜其中G-C质量分数应在60%-65%67所以长的菌内的一类基因组DNA自发转录的反义RNA4通过碱基反义RNA并不比短的反义RNA有效。在原核生物中针对互补原理与靶RNA主要是mRNA)配对结合抑制靶 RNA SI序列及其附近区域的反义RNA可能有效。真核生物中,的功能从转录水平和翻译水平调节相关基因的表达发挥对应5′端非编码区的反义RNA可能比针对编码区反义其生物学作用。随着深入的研究反义核酸技术迅速地发展R中国煤化工不应有开放读框,否则该起来反义寡核苷酸其优点在于高度靶特异性(碱基互补)反义的配对结设计多样、合成容易及高度的局部性和针对性是常规药物合。N形成位点或者3端非翻的设计、生产和作用所不可比拟的。现在人们广泛应用人工译区、mRNA5’端非翻译区、nRNA编码区(主要是起始密收稿日期2002-10-17修回日期2002-12-24。作者简介曹长姝1975-)女大连人硕士第4期曹长姝等反义核酸技术及应用码)这些区域的AXON可产生明显的抑制功能8但高效的作用这是S-oigs最显著的特点。②甲基化寡核苷酸低毒的反义寡核苷序列设计尚无眀确的规律要证实反义寡(M-ogos)可对抗细胞内酶的水解对细胞无毒性作用已核苷对靶mRNA的特异性抑制、排除非特异作用机制除检用于培养细胞上抑制病毒基因或內源性基因的表达。③聚测靶mRNA表达及蛋白质外更重要的是要设立必要的对酰胺核酸ⅣNA)汉称肽核酸其保留核酸结构中最主要旳照。常用的对照有正义链( sense)错义链( missense)及反义碱基结构其他两种结构〔戊糖和磷酸残基变成线性酰胺tit( antisense 1结构故PNA是一连串的酰胺基相连的长链与一系列单个反义寡核苷酸旳稳定性问题用化学修饰的方法有可能碱基相连的新型物质。近年来随着ASN纯化合成的硏究得到解决。目前认为靶向转运系统可能解决反乂寡核苷酸技术进展多种化学修饰的ASON问世其中最具代表性的摄取及转运问题。已研究的特异性靶向技术包括受体介导是第一代反义核酸药物的硫代ASON但与天然结构反义核的靶向转运、免疫脂质体靶向及毫微粒靶向、信号肽转运苷酸相比其与靶πNA特异结合能力减弱;与一些细胞因signal peptide sP)或HIⅤg4l蛋白融合序列的寡肽载体子、受体、蛋白结合能力增强可受到3’核酸酶降解等缺点。等而且后两者不需要经过內吞过程可以有效地将反义核因此在应用中提高ASON的稳定性和保持其生物学活性酸转运至细胞核。是选则ASON化学修饰物的关键因素。4反义寡核苷酸的剂量、给药途径和方式以及毒性6反义核酸技术的应用4.1反义寡核苷酸的剂量用反义寡核苷酸选择性抑制基因表达的功能对于生物在不同的临床前药效研究中寡核苷酸旳有效剂量不同,医学硏究有着深远的意乂特别是对于一些功能性的基因。与下列因素有关(1所用动物的种系及疾病的种类(2凛寡应用这种技术可使许多疾病得到治疗或缓解15作为一组核苷酸的化学性质(3给药方法和途径。所以有效剂量尚复合物被发展为治疗剂。例如有一种反义寡核苷酸应用于有待于探索。巨细胞角膜炎的治疗161因为目前许多眼部疾病没有满意4.2给药途径和方式的治疗方案而这项技术为治疗眼部疾病提供了广阔的前在体内实验中可以全身给药。为了避免多次给药可景。肿瘤一直是医疗工作者要攻克的顽症对于肿瘤的化学采用微渗透泵等装置。优点在于能持续释放药物维持治疗在以往的化疗药物可对病人身体产生一定的副作用有效浓度缺点在于用药结束后必须手术去除。对临床应用缺乏特异性肿瘤学家正在探索多种治疗方法,以提高对肿来讲生物体兼容的、生物学上可降解的持续释放裝置更好瘤细胞的特异性。现有大量的证据表明反义药物是安全的些。现有利用腺病毒在体内表达相应的反义核苷酸以达而且在人体肿瘤的动物模型中显示其功效1。而且体内外到治疗目的1对较为局限的病灶可局部给药采用局部实验证眀AS○N能特异性扣制肿瘤细胞增殖是治疗肿瘤潜注射或局部微渗透泵。现已研制岀来的EP-2010是一种在的新型药物。反义核酸技术亦应用于心脏、肾移植、延长呼吸系统反义寡核苷酸作用于腺苷№2贗体G-蛋白偶同种移植的生存期等临床治疗。而且这项技术作为联受体作为一种气雾剂直接被输送到肺12这样全身不良种基因治疗越来越有效地服务于药物开发人类的致病反应轻给药方便,而且肺吸附面积较大,带有表面活性物菌金葡菌复杂的基因分析通过反义技术调节基因的表达取质冋促进药物在肺组织的分布在哮喘的治疗发挥重要的得成功提供了一种分析葡萄球菌基因产物的方法这可应作用用于抗生素的开发20。在美国已有10种以上的反义寡核4.3反义寡核苷酸的毒性苷酸作为治疗药物进入临床前期实验阶段。在基础研究方反义寡核苷酸的毒性与动物种类和用药剂量有关。腹面已用于研究G-蛋白、磷脂酶((PLC)蛋白激酶C的作腔或皮下给药与其在体内的分布特点相符有可能分布除用以及与癌症有关的功能脑以外的各种组织对肾脏、肝、脾、骨髓等系统器官产生反义核酸技术对于RNA表达调控有巨大的潜力。近年定的毒性作用大部分ASON最终在网状內皮系统的器官中来反义寡核苷酸的生物学特点、临床前研究和临床试验研积累。因此这些器官既是其发挥作用的场所同时有可能究取得了相当的进展但这项技术的成功率不高反义寡核受到侵害。也有报道在小鼠和大鼠中寡核苷酸的毒性与苷酸其作用机制、作用的选择性、特异的核苷酸序列设计、化序列相关13对灵长类动物猴的实验中寡核苷酸的毒性学修饰和剂型设计、靶组织的有效给药方法、有效剂量及安与其化学修饰相关13全性等问题尚需解决。表达的反义寡核苷酸能有效并长期5常见的人工合成的反义寡核苷酸地降低一种基因的表达狙不能区分部分相似序列等一系列问题中国煤化工基础研究及临床治疗提供由于正常结构的反义寡核苷酸片段易被细胞内和体内了广CNMHG新的途径大量存在的核酶降解很难达到预期效果通常采用其化学修饰产物硫代磷酸化反义核苷酸s- oligos)是在磷原参考文献子上含有一个硫取代氧的结构具有较强核酸酶抗性能激「1] Walton sp, Stephano∞usGN, Yarmush m,etal.活 Rnaseh从而引起靶降解等特性成为目前反义应用研究Thermodynamic and kinetic中最多的一种修饰寡核苷酸在细胞中具有明显的抗核酸酶oligodexynucleotide binding to a structured mRNA J ] J大连医科大学学报第25卷Biophys20028x1)366-3(13)3038-3041[2 ]Tamm I, Dorken B Hartmann G. 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It has importment realistic valuleKey words: antisense technology antisense oligoneucleotide EP2-2010H中国煤化工CNMHG