酶工程研究及应用

Sum 120 No. 92005年9月文章编号:1002-1124(2005)09-0029-04综酶工程研究及应用述陈红霞(山东济宁职业技术学院生物化学工程系,山东济宁272037)摘要酶工程是现代生物技术的重要组成部分,它作为一项高新技术将为各工业的发展起重要推动作用。介绍了酶固定化、基因工程菌(细胞)的固定化、植物细胞培养产酶、酶的化学修饰、核酸酶、抗体酶、酶标药物的理论和技术研究的最新进展以及酶工程在各工业中的应用,对酶工程的发展前景进行了探讨关键词:酶工程;酶的固定化;核酸酶;抗体酶;应用中图分类号:Q814文献标识码:ACHEN Hong-xiaDepartment of Biology Chemistry, Jining Vocational and Technological College, Jining 272037, China)Abstract: Enzyme engineering is an important composing part of modem biotechnologies, it will take great effect inindustry as a new technology. The new advance in enzyme engineering research includes such as enzyme immobilizationmodification of enzymes, ribozyme abzyme enzyme labelling drug and the application of enzyme engineering in常用的载体有纤维素、琼脂、对氨基苯磺酰(ABSE)1酶工程技术纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、对氨基苯纤维素及苯胺1.1固定化酶和固定化细胞多孔玻璃等;包埋法是将酶(细胞)限制于凝胶网格固定化酶是指将可溶的自然酶束缚在特定的支内或微囊中的技术,如底物及产物为易溶于水的小持物上或固定在局限的空间,并能发挥催化作用,而分子时,可采用此法制备固定化生物催化剂。载体固定含酶的细胞则形成固定化细胞。我国研制过的有聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶琼脂、血纤维、胶原蛋固定化酶或细胞已有50种左右,可分为3种类型白、聚丙烯酰胺凝胶、丙烯酸高聚物等;选择性热变固定化单酶或含特定酶的细胞;固定化双酶将两种性技术是将酶限制于细胞内,但细胞内酶不变性的酶共固定在一种载体上或分别固定后串联在一起使技术。工业中包埋法应用较多,其次是吸附法。目用固定化各类激酶构成ATP再生系统。固定化的前已用的生物催化剂有酶膜酶片、酶块、酶纤维酶方法主要有吸附、共价结合、包埋和选择性热变性珠、酶管和酶微囊等形状。等。固定化过程必须使用水不溶性固体支持物(载固定化细胞包括微生物细胞、动物细胞和植物体)。吸附法是利用吸附剂、表面作用力或离子交换细胞,目前更多地注重活细胞和增殖细胞的固定化剂电性作用将酶(细胞)定位于载体表面的技术,当植物细胞固定化大多采用包埋法,处于静止生长期底物或产物为大分子或水溶性较差的小分子物质的植物细胞用琼脂、琼脂糖、海藻酸钙或角又菜胶固时常采用此法制备固定化生物催化剂。常用载体定,可获得较高活力的酶制剂。也可用聚氨酯尼龙有活性炭、氧化铝、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅或聚丙烯酰胺在有细胞存在时聚合成胶。至今已报胶、石英砂、 Amberlite IRA、 AmberliteIR、DEAE-纤维道了固定化南洋金花烟草胡萝卜等十多种细胞的素、CMC、DEAE- Sephadex等;共价结合法是将酶研中国煤化工行中药有效成分的(细胞)与载体之间通过共价健结合而固定的技术CNMHG动物细胞固定化只有王付用日前动物细胞微囊化法用得最多的是聚赖氨酸/海藻酸( PLL/ALG)法,细胞收稿日期:2005-05-17作者简介陈红(192),女,山东济宁人,副教授,主要研究方生长密度可达108-100未来将有一大批具有生物酶工程及应用。活性的蛋白质可依赖固定化细胞在生物体外大规模陈红霞:酶工程研究及应用2005年第9期的合成。醇法、聚顺丁烯二酸酐法等。酶与高分子化合物结1.2基因工程菌(细胞)的固定化合后,可以增加酶的稳定性和活力。例如抗白血病生物细胞合成的酶量由于机体生命活动平衡调药物天冬酰的游离氨作用、酰化反应进行修饰后,该节的需要,一般不会表达出很高的浓度,从而限制了酶在血浆中的稳定性有很大提高;胰凝乳蛋白酶与直接利用天然酶来解决更多化学反应的可能性,应水溶性大分子化合物右旋糖酐结合后,其催化活力用基因重组技术将生物细胞中存在的极少的催化某提高4倍6。常用修饰剂主要有乙酸酐、氮芥类、磷生化反应的酶通过基因扩增和增强表达,建立高氧酰氯、环氧丙烷重氮盐类羟胺等效表达特定酶制剂的基因工程菌或基因工程细胞,1.5核酸酶和抗体酶从而进一步构建成固定化工程菌或固定化工程细胞核酸类酶是一类由核糖核酸(RNA)组成的酶,的新一代催化剂。如德国BM公司应用蛋白质工程进一步的研究发现核酸酶不仅可以作用RNA和技术对表达青霉素酰化的基因进行点突变改造,重DNA,而且还作用于多糖、氨基酸酯等底物。核酸酶建了青霉素酰化酶工程菌,从而大大延长了固定化还同时具有信使编码功能和催化功能,实现遗传信青霉素酰化酶的使用半衰期,其酶柱可连续使用息的复制、转录和翻译;核酸酶具有核酸序列的高度700d以上山。应用DAN重组技术建立了丝氨酸和特异性,从而使核酸酶具有很大的应用价值,只要知色氨酸合成酶工程菌21。道某种核酸酶的核苷酸序列,就可以设计合成催化1.3植物细胞培养产酶其自我切割和断裂的核酸组成,根据这些基因组的是20世纪80年代发展起来的新技术。首先选全部序列,就可以设计并合成出防治有这些病毒引择适宜的植物外植体,经诱导、选育得到优良的植物起的人、畜和植物病毒病的核酸酶,如能够防治流细胞,再在人工控制条件的生物反应器中培养植物感、肝炎、艾滋病和烟草花叶病等。核酸酶也可以治细胞,以生产色素、香精和药物等次级代谢物。植物疗某些遗传病和癌症,还可以用作研究核酸图谱和细胞培养不受地理环境和气候条件等的影响,具有基因表达的工具6。生产周期短、产率高等显著特点,已经发展成为生物抗体酶( Abzyme)又称为催化性抗体,一类具有工程研究和开发的重要领域。郭勇等人2先后进行生物催化功能的抗体分子。抗体酶可以采用诱导法了植物细胞培养生产次级代谢物的研究,选育出了和修饰法获得。修饰法是采用分子修饰技术,将抗优良的木瓜细胞、大蒜细胞、鼠尾草细胞、玫瑰茄细体结合部位的结构改变成为酶分子的活性中心,从胞、黄花蒿细胞胡萝卜细胞、巴戟天细胞和银杏细而产生有催化活性的抗体。诱导法可以采用某种酶胞等,分别用于生产木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、为抗原诱导生成该酶的抗体,再以该酶的抗体为抗过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等药用酶以及色素、药原诱导抗体的产生。这样,抗体的结合部位与作为物等次级代谢物。抗原的酶的活性中心具有相同的构象,就有可能筛1.4酶的化学修饰选得到抗体酶。也可以采用某种化合物为半抗原,酶的化学修饰是指利用化学手段将某些化学物将它与蛋白质相结合后作为抗原诱导抗体酶的产质或基团结合到酶分子上,或将酶分子的某部分删生2。抗体酶已经用于酶作用机理的研究、手性药除或置换,改变酶的理化性质,最终达到改变酶的催物的合成和拆分抗癌药物的制备6化性质的目的。目前修饰剂的选用和修饰方法上有1.6酶标药物较大进展:(1)修饰酶的功能基团,如氨基、羟基、咪近来,人们可以根据药物在生物体内可能的作唑基等可离解基团;有酰化法、烷基化法、丹磺酰氯用目标,如酶或受体来设计药物,由此获得的药物被法等,如抗白血病药物天冬酰胺酶4,经修饰后可使称为酶标药物。目前这种设计方法已成为药物设计其在血浆中的稳定性提高数倍。(2)进行酶分子内的主流,在新药设计中发挥了巨大作用。血管紧张或分子间交联,应用某些双功能试剂分子两端的功素能基团如醛基等可使酶分子内或分子间肽链的两个实游离氨基分别发生交联,主要有右旋糖苷溴化氰法、青YHa中国煤化工药物的一个成功的CNMHG降压药物。细菌对足扌L素的诱导下大量合羰二亚胺法、戊二醛法等。例如交联后的人a-半成青霉素酰胺酶,从而大大加快青霉素的水解造成糖苷酶A,其热稳定性和抗蛋白酶的性能都有明显的。人们已经能够利用青霉素酰胺酶除去青霉素分增加5。(3)酶与高分子化合物结合,主要有聚乙烯子中的苄基,代之以其他基团而获得能够抗青霉素2005年第9期陈红霞:酶工程研究及应用酰胺酶的新青霉素。近来的研究发现,对人类健康由于外原性酶在体内易产生免疫反应,且稳定构成巨大威胁的艾滋病的感染和传播,主要是由艾性差,又难达到特定部位,因此,固定化酶、人工细滋病病毒颗粒表面的蛋白酶引起的。因此,艾滋病胞脂质体及红细胞膜包埋酶工程技术在临床治疗病毒蛋白酶的研究成为一个热点,人们希望通过对中的应用日趋活跃。将固定化酶应用于体内作为治艾滋病病毒蛋白酶抑制剂的研究,寻找出防止艾滋疗药物;将固定化酶组装成体外生物反应器,通过体病病毒感染和治疗艾滋病的方法8,9外循环作为临床治疗剂。从植物中克隆苯丙氨酸脱氨酶基因,导入肠道有益菌乳酸乳球菌中表达,用以2酶工程技术的应用治疗引起儿童智力障碍的苯丙酮尿症,已在动物试现代酶工程具有技术先进厂房设备投资小、工验中获得成功。酶传感器已广泛用于工业发酵艺简单能耗粮耗低产品收率高效率高、效益大和临床监测及监护,如安放于静脉或动脉中的葡萄糖污染小等优点,正日益成为食品、化工医药工业应用传感器能持续不断地监测血糖含量,并将指令传给方面的主力军。以往采用化学合成、微生物发酵及植入人体的胰岛素泵,控制胰岛素释放量,而使糖尿生物材料提取等传统技术生产的产品,皆可通过现病人获救代酶工程生产甚至可获得传统技术不可能得到的2.3酶工程技术在食品工业的应用昂贵产品,如昂贵药品人胰岛素、MAb、IN、6-应用酶工程技术生产食品添加剂,如海藻酸钙APA、7-ACA及7-ADCA等。固定化基因工程菌包埋乳酸菌生产乳酸,采用从豆类提取的脂肪氧合工程细胞以及固定化技术与连续生物反应器的巧妙酶或均质的植物组织,如莴苣叶可将亚油酸转化成结合,将导致整个发酵工业和化学合成工业的根本具有新鲜、青香气息的顺-3-已烯醇和反-2-己性变革。烯醇,采用玉米麸质粉为主要原料,经a-淀粉酶液2.1酶工程技术在医药工业中的应用化、水解、脱色脱臭及干燥制得新型食品添加剂玉米应用固定化细胞可大量生产各种初级或中间产蛋白发泡粉;应用酶工程技术进行功能食品成分的物,产品有D-葡萄糖、D-果糖、甘油、1,6-二磷酸开发,可生产活性多糖低聚糖活性肽及氨基酸、核果糖、柠檬酸、苹果酸、富马酸、乳酸、右旋糖酐、赖氨苷酸和糖醇等,如动物软骨经木瓜蛋白酶处理提取酸、6-APA、7-ACA及7-ADCA、麦角生物碱、羟化硫酸软骨素,壳聚糖经壳聚糖酶处理制得低聚壳聚孕酮、可的松和肉瘤碱等;应用酶工程技术进一步综糖卵蛋白经自身酶法脱糖后,加入蛋白酶进行酶解合应用了酶抑制剂,生化阻断突变株和细胞通透性制成卵白肽;酶工程技术在食品加工中有广泛应用,的改变等从而制得了雄甾-1,4二烯-3,17二酮如以玉米淀粉为原料,在糊化时加入耐热a-淀粉(ADD),雄甾-4-烯-3,17二酮(4AD)和3氧联降酶,采用酶脱支反应等手段改变淀粉原有的分子结胆甾1,4二烯-20酸(BDA)等关键中间体,使复杂构并重新结晶,可以提高产品中抗性淀粉的含量,果的天然资源经过几步反应就合成了各种性激素和皮胶酶可以提高果汁澄清度葡萄糖氧化酶用于果汁质激素,如应用固定化微生物细胞技术可生产强的脱氧化超氧化物酶用于乳清脱色等。松、11-去氧强的松、氢化可的松、△-胆甾烯酮、△24酶工程在环保中的应用雄二烯-3,17-二酮等甾体化合物;应用酶工程微生物在环境治理方面发挥了巨大的作用,各可以制造6-氨基青霉烷酸(6-APA),7-烷基头孢种微生物酶能够分解糖类、脂肪、蛋白质、纤维素、木烷酸(7-ACA),头孢菌素Ⅳ,7-氨基脱乙酰氧头孢质素、环烃、芳香烃、有机磷农药、氰化物、某些人工烷酸(7-ADCA),脱乙酰头孢菌素等抗生素,青霉素合成的聚合物。人们研究的用于环境治理的酶包括和头孢菌素前体物的合成的最新工艺也采用酶工程如下几类:处理食品工业废水,如淀粉酶、糖化酶、蛋的方法;应用酶工程生产氨基酸,制造2-酮基-白酶、脂肪酶、乳糖酶、果胶酶、几丁质酶等;处理造L-古龙糖酸,肌醇,L肉毒碱,CoA等维生素,由山纸中国煤化工奏酶漆酶等处理芳梨醇和葡萄糖生产维生素及丙烯酰胺的生产也采用香方酪氨酸酶、萘双氧酶工程的方法{;应用酶工程生产核苷酸类药物,合醇,CNMH0、以、腈水解酶氰化物水如ATP和AMP分别由氨甲酰磷酸激酶和激酶加乙合酶等;处理有机磷农药,如对硫磷水解酶、甲胺磷酸激酶制得等。降解酶等,处理重金属,如汞还原酶、磷酸酶等;还有2.2酶工程技术在医疗中的应用能够完全降解烷基硫酸酯和烷基乙基硫酸酯或部分陈红霞:酶工程研究及应用2005年第9期降解芳基磺酸酯的烷基硫酸酯酶等。随着人们研究参考文献的深人,酶工程技术必将在各种工业废水和生活污[1]吴梧桐酶工程技术的研究及其在医药领域的应用[J药学进水的治理中发挥越来越大的作用。展,1994,18(3):129-134.[2]郭勇酶工程研究进展与发展前景[J].华南理工大学学报(自3酶工程技术研究应用前景然科学版),200,30(11):130-133[3」曾庆平,郭勇植物细胞对环境胁迫的适应性应答[J应用与酶工程的发展在生物工程学科的发展中占有重环境生物学报,199,5(2):152-159要位置。2世纪,生物科学与生物工程的发展将进4王正样,刘吉泉,诸葛健,[1]生物工程学报,x0016(3步揭示生命的奥秘,在世界科技和经济发展中起[5]甄朱.[J].生物工程学报,2001,17(5):491-493主导和支柱作用。作为生物工程重要组成部分的酶6郑成酶工程的研究进展简述[].韶关学院学报(自然科学工程亦将飞速发展,前景广阔。21世纪酶工程的发版),2001,22(6):39-44.展主题是31:新酶的研究与开发,酶的优化生产,酶7]居乃琥21世纪工程研究的新动向[】,工业微生物,200,31的高效应用。除采用常用技术外,借助基因组学和(1):37-4蛋白质组学的最新知识,借助DNA重排和细胞、噬[8]Kozarich, ]. W. And Rich, D H [JI. Current Opinion ChemBiol997,(1):149-150.菌体表面展示技术进行新酶的研究与开发,目前最o]马晓建白净任珂,等,酶工程研究的新进展[]化工进展令人瞩目的新酶有核酸类酶、抗体酶和端粒酶等2003,22(8);813-817充分发挥酶的催化功能、扩大酶的应用范围、提高酶101 Yair Aharonowit.etl, J]. Biotechnology,99,(1m):807-810的应用效率是酶工程应用研究的主要目标,要采用1穆小民,吴显菜,酶的开发利用与工程[,世界生物技术,固定化分子修饰和非水相催化等技术实现酶的高(21)潘仁莉、酯工程研究开发的进展和建议(1.生物学杂志效应用,将固定化技术广泛用于生物芯片、生物传感1998,15(6):21-23器、生物反应器、临床诊断药物设计、亲和层析以及13]来芸.酶工程的发展热点—生物传感器].科技前沿蛋白质结构和功能的研究,使酶工程技术在各工业2001,(10):44.中发挥更大的作用。(上接第25页)J]重庆工业高等专科学校学报,2004,19(1):1-6但仍然存在许多制约其广泛应用的问题值得深入地许振良膜法水处理技术M.化学工业出版社,201尽管陶瓷膜的研究与应用已经取得了很大的进展,(101]王怀林,王忆川,姜建胜,等陶瓷微滤膜用于油田采出水处理研究[J].膜科学技术,研究和探讨主要是如何降低陶瓷膜的生产成本;如(12)徐南平,邢卫红,王沛,无机膜在工业废水处理中的应用与展何提高膜的分离效果及长时间维持膜通量的稳定望[].膜科学与技术,2000,20(3):23-28.性;如何扩展无机陶瓷膜的应用范围和应用深度等。[131mnA.,s.C. Using membrane to recycle two nonionic alkaline metal这些都应是今后陶瓷膜的制备和应用方面应重点突cleaning solution [J]. Memb Sci., 1999, 162: 219-234破的方向。[14 R. J. Lahiere, K P Goodboy Ceramic membrane treatment ofpetrochemical wastewater J]. Envir. 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