热变性和热聚集对大豆分离蛋白溶解性的影响

1062008W29,No.07段品利写※基础研究热变性和热聚集对大豆分离蛋白溶解性的影响叶荣飞,杨晓泉*,郑田要,郑恒光,朱建华,刘翀,司华静(华南理工大学轻工与食品学院食物蛋白工程研究中心,广东广州510640)摘要:研究了温度和浓度对大豆分离蛋白(SP)溶解性的影响,并用 SDS-PAGE电泳分析了其可溶部分中亚基的组成及聚集方式。结果表明,热诱导大豆蛋白聚集生成了可溶聚集体,使得低浓度热处理后完全变性的SPI具有良好的溶解性。关键词:大豆分离蛋白;热处理:溶解性;变性:聚集Effects of Thermal Denaturation and Aggregation on Solubility of Soy Protein IsolatesYE Rong-fei, YANG Xiao-quan, ZHENG Tian-yao, ZHENG Heng- guang, ZHU Jian-hua, LIU Chong, SI Huajing(Research and Development Center of Food Proteins, College of Light Industry and Food,South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)Abstract: The effects of temperature and concentration on the solubility of soy protein isolates(SPD) were studied, and thenthe subunit compositions and form of aggregation of soluble fractions obtained from treated SPi were analyzed by SDS-PAGE.The results showed that the totally denatured SPl after thermal treatment at low concentration have good solubility due to formationof heat -induced soluble protein aggregatesKey words: soy protein isolates(SPI); thermal treatment; solubility: denaturation; aggregation中图分类号:TS2017文献标识码:A章编号:10026630200807-010603大豆分离蛋白不仅是一种蛋白含量高的大豆产品脱脂豆粕山东新嘉华有限公司。而且还因具有多种功能特性而广泛应用于各类食品。但所用化学试剂均为分析纯。是,在大豆分离蛋白的生产中,热杀菌、高温喷雾干ECP3000三恒电泳仪北京六一仪器厂;600E蛋白燥等生产环节都会导致大豆蛋白发生不可逆的热变性。纯化系统美国 Waters公司; ALPHA-4冷冻干燥机日热变性导致蛋白质的解离,卷曲紧密结构的展开和疏水本东京理化公司;TAQ100差示量热分析仪美国PE公基团的暴露。由于展开分子的大量聚集,蛋白质的变司:CS501超级恒温水浴锅上海浦东跃欣科学仪器性通常会引起溶解度的下降,从而影响其功能特性,限厂;CR2G高速冷冻离心机日本日立公司:压力灭制其应用。但是,蛋白质的变性不一定导致溶解性下菌锅上海博迅公司。降,国外已有研究表明21,在一定的条件下,大豆分1.2方法离蛋白即使是完全热变性,也能具有高溶解性。121SP的制备热处理条件下,大豆蛋白的热变性、聚集与溶解低温脱脂豆粕粉碎后过60目筛。豆粕粉按1:10的性之间关系的研究,对提高大豆分离蛋白的溶解性具有料液比加水搅拌,用1 mol/L NaoH调pH至75,浸提重要的理论和实用价值。本实验研究温度和浓度对溶解2h后离心(8000×g,20min,4℃),取上清液用1mo性及大豆蛋白亚基组成的影响,并选取2%的溶液研究HC调pH至45,静置05h后再次离心(500×g,20min,了可溶部分的热变性情况和聚集物的生成,以期为大豆4℃),弃去上清液,加水并用1 mol/L NaOH调蛋白凝乳分离蛋白生产中的热加工提供一定的理论指导。的pH至70,经冷冻干燥后即得SPI。凯氏定氮法测得sPI的蛋白含量为886%。1材料与方法1.22SPI的热处理中国煤化工w/V)分别为2%11材料、试剂与设备4%、CNMHG备三份,磁力搅拌2h,收稿日期:20071001小mw水浴)和120℃(灭菌基金项目:国家自然科学基金项目(20776050);广东省自然科学基金项目(07006508)作者简介:叶荣飞(1983-),男,硕士研究生,研究方向为粮食油脂及植物蛋白。E-mail:yeyunfeil1314@tom.com*通讯作者:杨晓泉(1965),男,教授,博士,研究方向为大豆蛋白的开发利用。E-mail::fengyang@scut.edu.cn※基础研究品科宝2008,vl.29No.07107锅中进行)加热30min,迅速用冰浴冷却5min,再经高亚基(a'、α及β)通过非共价作用构成的三聚体。速分散均质机分散后冷冻干燥。因为β-巯基乙醇可还原而断开二硫键,所以通过123溶解度的测定对比还原和非还原电泳图可判断亚基间是否有二硫键交称取0.5g各干燥样品(经热处理的sPD,用蒸馏水联。图2显示不同浓度的SP溶液在80℃下加热30min后,其可溶部分的亚基没有明显变化,其中图2(b)表明20℃).用凯氏定氮法测上清液(可溶部分)的蛋白含量。AB(分子量约为58kD仍明显存在,说明AB之间的二硫上清液的蛋白含量与样品蛋白含量的比值即为溶解度。综合图2(a)和图2(b)分析,构成小聚集物和大聚集物的124 SDS-PAGE电泳亚基相互作用力以二硫键为主。根据 Laemmli U K的方法,在不连续缓冲系统上人案集物进行 SDS-PAGE电泳分析,浓缩胶和分离胶的浓度分别为4%和12%,考马斯亮蓝R250染色。还原电泳样品小聚坐物缓冲液中含10mmo/LB-巯基乙醇,其他成分与非还原SDS-PAGE电泳缓冲液相同。参照123制备上清液,冷43kD冻干燥后用于电泳分析sOkD s125凝胶过滤参照1.23制备上清液,上样量为5m1。采用20.1kDSepharose CL-6B凝胶柱,洗脱液用Tris-HCl缓冲液144kD1234567891011pH75,含有01 molL Nacl)。流速为1m/min,每3ml收集一管,收集的组分在280nm检测。盘还原 SDS-PAGE图谱(添加B巯基乙醇)hb.非还原 SDS-PAGE图谱1.26差示量热扫描(DSC)(未添加β·巯基乙醇)。1为 Marker;2为未热处理的sP:3~7为参照1.23制备上清液,冷冻千燥后用于DSC分析。2%、4%、6%、8%和10%的SP溶液在80℃加热30mn后可溶部分称取2mng样品放入铝盘中,加入10μ1磷酸盐缓冲液(pH70)的还原电泳图谱:8~11为2、%、6%和8%的SP溶液在80℃加使样品混和均匀,参考盘为空铝盘,扫描温度范围为热3mn后可浴部分的非还原电泳图20~120℃,升温速率为10℃/min图2不同浓度的P溶液在80℃加热30min后可溶部分的8PA旺E图谱Fig 2 SDS-PAGE pattems of soluble fractions obtained from结果与分析different concentrations SPl thermally treated at boCfor 30 min图3(b)显示,SPI溶液在100℃下加热30mn后,AB21溶解度测定已经解离,表明在此热处理条件下,AB之间的二硫键已断开。图3(a还显示,当浓度在6%以上时,上清液即可溶部分中的B和β已不存在,但A、α'和α还明显存在→120℃根据 Yamagishi T等习用15和7S来做的模型实验结论可推测,此热处理条件下A、a和a通过二硫键相互作用形成可溶性聚集物,而B和β形成了不溶聚集物浓度(%,W/V)图1不同浓度的8P|经不同温度热处理后的溶解度曲线Flg.1 Solubility profiles of different concentrations SPl afterthermal treatments of different temperatures图1显示不同浓度的SP经不同温度热处理后的溶解度曲线。在不同热处理温度下,溶解度随着浓度的增加而明显下降。低浓度时显示较好的溶解性,特别是12345678910112%的SPI分别经80、100和120℃热处理30min后溶解度都在80%以上a还原SDs-PAGE图谱:b非还原 SDS-PAGE图谱;1为未热处理的22 SDS-PAGE分析SPI大豆蛋白主要由大豆1S球蛋白 glycinin)和7S球蛋白30miV凵中国煤化工,1(β conglycinin)组成。11S是一个六聚体,它由六个酸性CNMH分的非还原电泳图谱。图3后可溶部分的S0SPAE图谱亚基(A)和六个碱性亚基(B通过二硫键连接组成,这两种Fig 3 SDS-PAGE patterns of soluble fractions obtained from亚基的分子量大约分别为38kD和20D。7S是类由三种 different concentrations SPl thermally treated at100tor3omin1082008W29M.07品酗军※基础研究度相差不大,又因为上样量相同,因此可确认热处理后的SPI的第一个洗脱峰增加的主要原因是分子量较大的可溶聚集体的增加。2.84261910060120180240300360420a还原 SDS-PAGE图谱:b非还原 SDS-PAGE图谱:1~5为2%、%、6%、8%和10%的SPI溶液在120℃加热30min后可溶部分的还未加热;80℃下热处理;c.100℃下热处理:d.120℃下热处理原电泳图谱;6~10为2%、4%、6%、8%和10%的SPI溶液在120图6$P溶液(2%)在不同温度下加热30mn后可溶部分的凝胶过滤图谱℃加热30min后可溶部分的非还原电泳图谱Fig 6 Gel filtration chromatograms of soluble fractions obtained图4不同浓度的sP|溶液在120℃加热30min后可溶部分的 SDS-PAGE from SP(2%) thermally treated at different temperatures for3omnFig4 SDS-PAGE pattems of soluble fractions obtained from3结论different concentrations SPl thermally treated at 120C for 30 min31SPI的溶解性随着热处理时浓度的降低而明显升如图4所示,分离胶中各亚基带颜色明显变浅,而高。2%浓度的SPI经不同温度热处理后,其溶解度均在浓缩胶顶部有很明显的聚合物形成。说明该可溶部分能达到80%以上。主要由聚集物组成,构成聚集物的作用力不是疏水相互3280℃下热处理时,SPI部分变性,11S中的AB未作用和二硫键,可能是蛋白质与蛋白质发生了反应而通解离:100℃热处理时,11S完全变性,AB解离,亚过共价键相连接。基A可能与a和a通过二硫键交联形成了可溶聚集体23热变性分析而B与β形成了不溶聚集体;120℃热处理时,蛋白质与蛋白质可能发生了某种反应而共价连接。分析表明热诱导大豆蛋白聚集生成了可溶聚集体,使得低浓度热处理后完全变性的SPI具有良好的溶解性参考文献]王风翼,钱方.大豆蛋白质生产与应用M北京:中国轻工业出版-社,2004,77-8180[2 WAGNER JR, SORGENTINI D A Relation between solubility and度C℃)phobicity as an indicator of modifications during prepara-未加热;b.80℃下热处理;c.100℃下热处理;d120℃下热处理tion processes of commercial and laboratory-prepared soy protein isolatesU J Agric Food Chem, 2000, 48: 3159-3165.图5P|溶液(21)在不同温度下加热30min后可溶部分的DsG图谦王显生不同亚基变异类型的大豆分离蛋白凝胶质构特性的研究门Flg.5 DSC thermograms of soluble fractions obtained from SPl中国粮油学报2006,21(3):116-120(2%)thermally treated at different temperatures for 30 min[4] ARRESE EL SORGENTINID A, WAGNERIR, ct aL. Electropboretic,solubility and functional properties of commercial soy protein isolates如图5所示,在未经热处理的SPI中,7s和11S的U. J Agric Food Chem, 1991, 39: 1029-1032.变性温度分别为74℃和95℃。2%浓度的溶液在80℃ LAEMMLI U K Cleavage of structural proteins during the assembly ofageT4小 Nature,190.22:680685下热处理30min后,其可溶部分的7S没有吸热峰,说阿 THANH V H, HIBASAKI K Major proteins of soybean seeds. A明7S已完全变性,但11S的吸收峰还很明显。而2%浓straightforward fractionation and their characterization[]. J Agric Food度的溶液在100℃和120℃下热处理3min后,其曲线为mchem,1976,24:111117PETRUCCELLI S. Thermal aggregation of soy protein isolates [].J条直线,说明此时蛋白质已完全变性Agric Food Chem, 1995. 43: 3035.3041.24凝胶过滤色谱分析中国煤化工mN, e al. Isolation and electro-如图6所示,与未加热的SPI对照,热处理后的CNMH1229-1237SPI的第一个洗脱峰显著增高。实验测得未经加热的SPI阴Effect of alkali on the的溶解度为813%,与经不同热处理的2%的SP的溶解refunctionalization of soy protein by hydrothermal cooking[].J Am Oi