乙醇脱氢酶对小鼠抗醉解酒作用的研究

陕西科技大学学报Aug.2009Vo.27JOURNAL OF SHAANXI UNIVERSITY OF SCIENCE & TECHNOLOGY文章编号:1000-5811(2009)04006303乙醇脱氢酶对小鼠抗醉解酒作用的研究毛跟年,李丽维,齐凤,张晓霞陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021)摘要:通过抗醉和解酒两项实验,观察了乙醇脱氬酶直接作为解酒药物的抗醉酒及解酒作用.结果显示,乙醇脱氩酶在防酒醉试验中的作用效果比较明显,尤其是在给酒后1h,小鼠血液中乙醇含量降低最明显,而对已经处于酒醉状态的小鼠的解酒作用效果并不明显关键词:乙醇脱氢酶;抗醉酒;解酒中图分类号:Q554+,9文献标识码:A0引言乙醇脱氢酶( alcohol dehydrogenases,简称ADH)是广泛专一性的含锌金属酶,以NADH为辅酶,化伯醇和醛之间的可逆反应.乙醇脱氢酶在人体内主要分布于胃壁和肝脏细胞中,在乙醇代谢中发挥着重要作用.近年来国内外的研究表明饮酒后有部分乙醇既未进入血液循环,也未潴留在消化道内,而是在胃内被氧化代谢,这一现象被称为乙醇的第一关卡代谢( First-pass metabolism of ethanol).胃乙醇脱氡酶是参与这一代谢的主要酶.胃内这一代谢可调节乙醇的生物利用度,进而影响乙醇对肝脏及机体的毒性作用.如果在胃内可以加强乙醇的分解,就可以防止其进入胃壁细胞以及肝脏细胞中,从而达到保护胃粘膜和肝脏的功效,同时也可以防止乙醇及乙醛进入血液循环,损坏人体的神经系统,造成其他的毒副作用1材料与方法1.1实验材料(1)ADH酶液:自制;胃蛋白酶、胰蛋白酶和辅酶: sigma公司;56°北京红星二锅头:北京红星股份有限公司;其他化学试剂均为国产分析纯(2)昆明种小鼠体重(20±2)g,雌雄各半,西安交通大学医学院实验动物中心提供,小鼠按常规方式饲养一周挑选健康正常者随机分组.实验前禁食12h,自由饮水(3)紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器厂);台式超速离心机(上海安亭科学仪器厂);微量移液枪( Gilson, france);超级恒温器(重庆试验设备厂);冰箱等.1.2实验方法1.2.1酸性重铬酸盐氧化法用涂有肝素的离心管接取新鲜小鼠的血6份每份取500L,用微量进样器按0、0.5、1、1.5、2、2.5、3L系列添加50%的乙醇,分别加入500L120%三氯乙酸沉淀蛋白,以800r/min冷冻离心沉淀6min,取上清液各600μL,加重铬酸钾硫酸试剂1.8mL,100℃水浴加热10min,取出冷却至室温.用空白水做参比液,测其在595nm处的吸光度值1.2.2血液中乙醇浓度的检测收稿日期:2009-05-04作者简介:毛跟年(1962-),男陕西省泾阳县人,教投研究方向:生物药物材料研究与应用基金项目:陕西省自然科学基金项目(SJ08B18)、陕西省教育厅专项科研计划项目(编号08JK236)陕西科技大学学报第27卷用移液枪准确吸取500L血样于预先涂有抗凝肝素的具塞试管中,加入500山L120%三氯乙酸以沉淀样品中的蛋白质,以8000/min冷冻离心沉淀6min,取上清液各600L,加重铬酸钾硫酸试剂1.8mL,100℃水浴加热10min,取出冷却至室温.用空白水做参比液,测定其在595mm波长处的吸光度值根据标准曲线回归方程计算小鼠血液中乙醇的含量1.2.3数据分析实验数据用X±S表示,采用配对t检验进行统计学分析2结果与讨论乙醇含量/AL2.1标准曲线的绘制2图1体内检测低浓度乙醇以小鼠血液中乙醇含量为横坐标,595nm处的吸光度为纵坐标含量标准曲线作图,绘制标准曲线,如图1所示回归方程为:y=0.0377x+0.1021,R2=0,9965.标准曲线的回归方程用于对小鼠体内的乙醇含量进行定量分析表1动物醉酒乙醇用量的确定22小鼠酒醉乙醇用量测定结果1醉倒时间/min在动物实验中,首先需要确定小鼠酒醉的乙醇用量,灌胃给组别123456酒的剂量太大容易引起小鼠中毒而死亡,剂量太小又不足以引1组(0.015mL/g)-1035起小鼠醉倒,故需要选用合适的剂量进行实验.实验对4组(每2组.016mLg)54651514组6只)不同给酒剂量的小鼠进行了考察,以1h内翻正反射消3组(0.017mL/g)21失的时间为指标,确定能够引起小鼠酒醉的乙醇用量4组(0.018mL/g)由表1可以看出,给酒剂量0.015mL/g不足以使小鼠醉注:“*”死亡;“一”未醉倒倒,有3只小鼠没有出现翻正反射消失,其醉倒率为50%0.018mL/g的剂量过大,有4只小鼠死亡;0.017mL/g的剂量下有2只小鼠死亡故实验确定0.016mL/g的剂量为小鼠酒醉的乙醇用量,在此剂量下小鼠醉倒率为100%且没有发生小鼠死亡2.3乙醇脱氢酶抗酒醉及解酒实验4将小白鼠随机分成3大组,每大组均包括实验组和空白对照组,每小组各8~10只小鼠表2乙醇脱氢酶防酒醉实验乙醇含量测定结果2.3.1乙醇脱氢酶抗酒醉实验观察时间对照组实验组乙醇含量降低各组小鼠均采用灌胃的方法一次性给h/(l/ml)/l/m1)百分率/%药,小鼠的用药剂量即为小鼠醉酒的乙醇0.56.08360.106157329±0.29545.0用量(0.016mL/g)给予实验组小鼠乙醇13.9823±0.13593.6287±0.0556·8.9脱氢酶与NAD液等比例混合液,空白对1.54.4951±0.15134.3178±0.08873.9照组小鼠同体积的生理盐水给药10min注:与对照组相比·P<0.05,P<0.01后,给予各组动物相同剂量的白酒(56°红表3乙醇脱氢酶解酒实验乙醇含量测定结果察时间对照组试验组乙醇含量降低后,各组小鼠均断头取血采用酸性重铬酸/h/(uL/mL)/(gL/mL)百分率/%盐氧化法测定小鼠血液乙醇浓度.实验结0.54.3979士0.12554.3360±0.09144.2211±0.25484.1680士0.1765果如表2所示1.54.2564士0.06424.2122±0.1860从表3可以看出,在乙醇脱氢酶防酒醉实验中,先给药再给酒,并在随后的0.5h、1h1.5h内对实验小鼠血液中的乙醇含量进行检测的结果显示,未给药的对照组(给生理盐水)小鼠体内的乙醇含量均高于实验组(给药)小鼠给酒05h后,实验组小鼠血液中的乙醇含量与空白对照组相比差异显著(P<0.05),乙醇含量降低了5%;给酒1h后,实验组小鼠血液中的乙醇含量与空白对照组相比差异极为显著(P<0.01),乙醇含量降低了89%;给酒1.5h后,实验组小鼠血液中的乙醇含量较空白对第4期毛跟年等:乙醇脱氡酶对小鼠抗醉解洒作用的研究照组相比差异显著(P<0.05),乙醇含量降低了3.9%,由此可以推测,可能在小鼠胃部时乙醇脱氢酶在辅酶的作用下参与了乙醇分解代谢的过程,乙醇很快降解,从而有效的阻止了乙醇进入血液循环.这种作用在给酒后1h内表现得最为明显.给药1.5h给酒,效果不明显,有可能是乙醇脱氢酶长时间在胃部的酸性环境下活性降低或失去活性,致使无法将乙醇降解,较多的乙醇被吸收2.3.2乙醇脱氢酶解酒实验按照0.016mL/g的剂量,先给各组小鼠白酒(56°红星二锅头),10min后再给各实验组小鼠相同剂量的药液(乙醇脱氢酶液与NAD液等比例混合液),对照组小鼠给予相同体积的生理盐水,分别于0.5h、1h、1.5h后,各组小鼠断头取血,采用酸性重铬酸盐氧化法检测血液中乙醇含量实验结果如表3所示由表3可以看出,在各检测时间段内,未给药的对照组小鼠血液中乙醇含量的平均值均高于给药的实验组小鼠,但实验结果经过t检验发现差异性不显著,表明乙醇脱氢酶在小鼠解酒实验中的作用效果并不显著.可能是在饮酒后,经食道、胃、肠道等器官乙醇已被体内吸收,再给药时,乙醇脱氢酶只能降解胃内部分的乙醇,而且随着时间的延长,乙醇脱氢酶酶活降低或活性丧失,因此在1.5h时乙醇含量的降低率很低3结论乙醇脱氢酶在乙醇代谢中发挥着至关重要的作用,它可催化乙醇生成乙醛,乙醛再在乙醛脱氢酶的作用下生成乙酸,经TCA循环最终生成CO2和H2O.本实验通过乙醇脱氢酶的防酒醉实验和解酒实验考察了其在体内分解乙醇的情况,并通过t检验进行了实验数据的统计学分析.结果表明,ADH在抗酒醉实验中的作用效果比较明显,尤其是在给酒后1h,血液中乙醇含量降低最明显,与未给药的对照组小鼠血液中的乙醇含量相比,乙醇含量降低了8.9%效果极为显著但在解酒实验中,乙醇含量降低都很小,实验所得数据没有统计学意义,表明乙醇脱氢酶对已经处于酒醉状态的小鼠的解酒作用效果并不明显推测原因可能是由于先给药再给酒,乙醇脱氢酶可很快将乙醇降解,从而有效的阻止了乙醇的吸收.而在解酒方面由于乙醇在体内极易吸收,饮酒后再给药,致使很多乙醇在未被降解前已被体内吸收,因而解酒效果不明显参考文献[1] Watanabe M. Immunohistochemical localization of ADH in the stomach before and after abstinence of alcohol in alcoholics-usingconfocal laser scanning microscopy[]. Kurume Med J. 1997,44(4),263[2]魏泓,医学实验动物学[M]第2版成都:四川科学技术出版社,2001:366388[3]王坤施前实用诊断酶学[M]上海:上海医科大学出版社,2000159162[4]李焕德许树梧急性中毒毒物检测与诊疗[M湖南:湖南科学技术出版社,2000:450605RESEARCH OF ADH ON THE ROLE OF ANTI-INEBRIATIONMAO Gen-nian, LI Li-wei, QI Feng, ZHANG Xiao-School of Life Science Engineering, Shaanxi University of Science Technology, Xi'an 710021, China)Abstract: Anti-inebriation of ADh was observed by means of alcohol-resistance experimentand alcohol-relieving experiment, it was indicated that ADH is excellent on alcohol-resistantit can reduce the alcohol in the blood, especially in the drink after l hour, but it has no significant effect on the alcohol-relieve for the mouse who was inebriatedKey words: ADH; alcohol-resistant; alcohol-relieve