合成分枝型聚乙二醇的简便新方法

Vol. 24高等学校化学学报No 82003年8月CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES1495~1498合成分枝型聚乙二醇的简便新方法何明磊,苏志国(中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京100080)摘要以赖氨酸和mPEG500为起始物,利用多肽合成中常用的保护、缩合和脱保护等方法合成了在生物医学领域中具有重要应用价值的分枝型聚乙二醇.用该方法形成的分枝型PEG在有机相中以缩合反应的方式一步完成,反应条件温和,且有较高的产率(61%).各步产物的表征都与其结构一致.最终产物分枝型PEG的HNMR的表征结果与其结构吻合关键词新方法;合成;分枝型聚乙二醇中图分类号O633.1文献标识码A文章编号0251-0790(2003)08-1495-04随着生物技术的飞速发展,越来越多的具有生物活性的多肽、蛋白质和酶被用于临床治疗.但是这些生物大分子在直接用于人体时还存在快速排除、被人体中的蛋白酶降解和免疫反应等缺陷.因此,蛋白质的化学修饰特别是医用蛋白质的化学修饰仍然是一个热门的研究领域.许多天然大分子及合成的高分子已经和正在被用于蛋白质的化学修饰.由于聚乙二醇(PEG)对人体无毒并且具有生物相容性,因此被广泛应用于修饰蛋白质、多肽及酶甚至一些小分子药物PEG是一种水溶性聚合物,当它与蛋白质分子(多肽,酶)以共价键结合后,能够降低这些活性分子的上述缺陷,甚至加强其潜在用途.例如,PEG与腺苷脱氨酶的结合物(PEG- adenosine deaminase)已经获得FDA(美国食品和药物管理局)的批准,PEG修饰的细胞因子( PEG-modified Cytokines)已经制备出来,PEG修饰的巨噬细胞集落刺激因子(PEG- modified granulocyte- macrophage colonystimulating factor)甚至表现出了分化的两种生物学性质.人们发现,用PEG修饰生物活性分子,其修饰效果与所用的PEG的分子量及一定的修饰度有关般PEG的分子量越大,修饰度越高,结合物的抗原性越小,而结合物的体内排除时间越长,但结合物的生物活性也随之减小.结合物生物活性的下降主要是由过度修饰引起的.为了解决这个问题,人们合成了分枝型聚乙二醇( BranchedPEG).用 Branched PEg修饰蛋白质等生物活性分子,可以在反应位点给定的情况下增加结合的PEG量.人们在研究中还发现,由于分枝型聚乙二醇的特殊结构,当它结合在蛋白质分子的表面后,其较大的位阻大大降低了结合物的抗原性,更有效地阻止了体内蛋白酶的水解.因此在修饰度相同的情况下,分枝型聚乙二醇的修饰效果优于线型聚乙二醇( Linear peg)现有的分枝型聚乙二醇的合成方法存在所用化学试剂昂贵,产率低,反应条件难于控制等缺点,限制了其研究和实际应用.本文开发了一种新的简便的分枝型聚乙二醇的合成路线,取得了较好的结果1实验部分1.I试剂与仪器单甲氧基聚乙二醇(mPEG50,M=5000),二环已基碳二亚胺(DCC),N-羟基琥珀酰亚胺NHS)购自瑞典 Fluka公司.其它化学试剂均为分析纯. Bio gel P100(100-200mesh)购自美国BioRad公司.dMX300型核磁共振仪(300MHz, Bruker inc)公司, FTIR Vector22型红外光谱仪( Bruker公司), Waters Series凝胶渗透色谱仪(Pump515, RI detector2410, Column ht3-5-6), BIFLEXⅢ型高等学校化学学报VoL 24质谱仪( Bruker公司).1.2赖氨酸乙酯盐酸盐的制备向500mL三角瓶中加入300mL无水乙醇和30g赖氨酸.在搅拌下将干燥的氯化气体通入上述悬浊液至饱和.赖氨酸逐渐溶解,加热回流后溶液透明.将此溶液密闭静置12h后,减压蒸岀氯化氢和过量的乙醇.溶液经浓缩后加入冷的无水乙醚中,此时有黄色晶体析岀,洗涤并在真空下干燥,得42g产物1.反应式如下NH2(CH2),CH(COOH)-NH2 +C H,OH +HCl()HCINH2-(CH2)CH(COOC, H; )-NH, HCI(1)对产物1进行红外光谱测定1.3羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇的制备根据文献[6]的方法制备产物2.反应式如下:MnomPEG--OHmPEg--CHO→ mPEG COOH(2)产物2的IR光谱在 FTIR Vector22红外光谱仪上测定(KBr压片)1.4分枝型PEG的合成将254mg( I mmol)的赖氨酸乙酯盐酸盐加入到装有25mL.二氯甲烷(干燥)的50mL.三角瓶中然后将4mmol的三乙胺(TEA)、2mmol(10g)的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇以及过量的DCC和NHS依次加入到溶液中.在磁力搅拌下于室温反应24h,过滤除去反应中生成的二环己基脲(DCU),然后将溶液慢慢地倾λ强烈搅拌下的150mL冷乙醚中,此时有乳白色沉淀生成.将沉淀滤岀并真空干燥,得9.5g乳白色粉末状物质,将其溶于50mL1mol/ L NaOH中,再加入10 g NaCl,于室温下搅拌反应1h,用6mol/L盐酸调节pH值为3.用二氯甲烷萃取(50mL×3),合并有机相,用硫酸镁干燥后将溶液减压浓缩至5σmL.将此浓缩液慢慢倾λ强烈搅拌下的3θ0m冷乙醚中,有乳白色沉淀析岀,滤出沉淀并真空干燥得9.0g产物3.反应式如下:mPEG-COOH+ HCINH2(CH,).CH(COOC H;)-NH2 HCIDCC. NHSmPEG-CONH-(CH2),CH(COOC, H, )-NHOC-mPEG OH.HmPEG CONH(CH2)小CH--COOH (4)mPEG CONH将产物3进行MALDⅠ-TOF质谱测定和GPC测定(产物3是产物2和4的混合物)1.5凝胶过滤( Biogel p100)纯化分枝型PEG及其HNMR表征将0.4g产物3溶解在2mL蒸馏水中,在装有 Biogel I100(100-200mesh)的色谱柱(5cm×50m)上,分2次上样(毎次1nL),以水为洗脱液进行凝胶过滤分离,以毎管10mL进行分步收集.将相对于分枝型聚乙二醇旳组分(通过碘显色反应鉴定)合并,用二氯甲烷萃取,乙醚沉淀,最后用乙醇结晶,得到0.24g乳白色产物4.在dMX300型核磁共振仪(300MHz, Bruker公司)上,以CDCl3为溶剂,TMS为内标测定产物4的HNMR谱2结果与讨论产物1的红外光谱如图1(A)所示.在1740.9和1218.9cm处出现了较强的羰基吸收峰,这是典型的饱和羧酸烷基酯C-O的特征吸收;而3422.2cm-处的—N-H伸缩振动峰相对较弱,这是由于形成盐酸盐所致.红外光谱说明产物1为赖氨酸乙酯盐酸盐.产物2的红外光谱如图1(B)所示.在1745.5cm-处出现较弱的羰基吸收峰,说明原料单甲氧基聚乙二醇中的羟甲基被氧化成为羧基分枝型PEG的合成实际上包括两个反应步骤.首先在有机相(CH2Cl2中实现了羧甲基化mPEGNo 8何明磊等:合成分枝型聚乙二醇的简便新方法14971.2}(A)1.604000300020002000p/cm-lFig. I IR Spectra of product I(A)and product 2(B)行了 MALDO-TOF质谱分析和GPC分析,结果见图2. MALDI-TOF的结果表明,产物3包括两种组分:一种组分是平均分子量为5089的聚合物,另一种组分是平均分子量为10263的聚合物.平均分子量为10263的聚合物为目的产物4.而平均分子量为5089的组分是未反应的原料羧甲基化mPEG.GPC结果显示了连在一起的2个峰.一个峰的分子量最高值为12054,另一个峰的分子量最高值为7088.由于GPC测定使用PS(聚苯乙烯)为标准物,因此12054和峰7088分别相对与MALDⅠ-TOF质谱分析中的峰10263和峰5089.根据GPC测定中的峰面积积分计算,平均分子量为10263的组分占混合物总量的61%2500}(A(B)50891500l000060001000014000t/minFig 2 MALDI-TOF spectrum(A)and GPC spectrum(B) of product 3产物4的HNMR,δ:1.2~1.4(多重峰,6H,赖氨酸的_CH2-3,4,5);1.6(多重峰,2H,赖氨酸的_CH2-6);3.14(单峰,3H,mPEG的末端甲氧基);3.49(单峰,mPEG骨架_CH2-);4.05(三重峰,2H,与羰基相连的_CH2—);7.11(三重峰,1,赖氨酸的ε-NH-);7.37(双峰,1H赖氨酸的αNH—).与已报道的该结构的HNMR的指纹图谱相当吻合,特别是由于两个不同的与羰基联接的NH质子的存在,第一个与羰基联接的—NH—质子由于还与CH,—相连而显示出三重峰,第二个与羰基联接的—NH—质子由于还与赖氨酸的α-CH相连而显示岀双峰.这一结果表明,平均分子量为10263的组分就是目的产物分枝型PEG现有的合成分枝型PEG的方法一般是通过赖氨酸与PEG反应.由于赖氨酸不溶于有机溶剂,因此现有的合成反应只能在水溶液中进行.在这种情况下必须精确控制反应溶液的pH值,而且产率较低.现有的方法都是通过活化氨基组分或者活化PEG组分来实现合成,在本文的方法中,我们首先通过酯化反应保护赖氨酸的羧基.这种方法不仅保护了羧基,由此形成的赖氨酸衍生物在有机溶剂中有良好的溶解性.因而使得合成分枝型PEG的反应能够在有机相中进行.我们通过多肽合成中常用的缩合反应完成了分枝型PEG的合成.该反应在室温下即可完成,而且不需要控制反应溶液的pH值,使个PEG分子在一步反应中都结合到赖氨酸分子上.此合成方法比现有方法简便且有较高的产率论高等学校化学学报VoL 24上迄今未见报道.与已有的合成方法相比,该方法简便、经济.参考文献[1] ZHOU Wen-Xiao(周文孝), YUAN Qing-Hui(袁庆辉). 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In this paper, a kind ofbranched PEG was synthesized via conventional methods used in the synthesis of polypeptide(protection, condensation, and deprotection using lysine and mPEG5000 as starting materials. Inthis method, the most important reaction of forming branched PEG was fulfilled in one step byondensation reaction in organic phase. It makes this method remarkably different from otherThe reaction condition is mild and the yield of the product(61%) is higher. Thecharacterization of products in different steps is consistent with their structures. The H NMRspectrum of our end product branched PEG tallies with its structure.Keywords New method Synthesis; Branched PEG(Ed: w,Z)2002年进入《 SCICDE的中国期刊ACTA CHIMICA SINICA(化学学报)ACTA MECHANICA SINICA(力学学报ACTA PHARMACOLOGICA SINICA(中国药理学报)CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES-CHINESI(高等学校化学学报)CHINESE JOURNAL OF CHEMISTRY(中国化学)MEDICAL JOURNAI(中华医学杂志)CHINESE PHYSICS LETTERS(中国物理快报)CHINESE SCIENCE BULLETIN(科学通报)COMMUNICATIONS IN THEORETICAL PHYSICS(理论物理通讯)SCIENCE IN CHINA SERIES A- MATHEMATICS PHYSICS ASTRONOMY(中国科学A-数学,物理,天文学)SCIENCE IN CHINA SERIES B-CHEMISTRY(中国科学B化学)SCIENCE IN CHINA SERIES C- LIFE SCIENCES(中国科学C-生命科学)SCIENCE IN CHINA SERIES D-EARTH SCIENCES(中国科学D-地球科学SCIENCE IN CHINA SERIES E- TECHNOLOGICAI. SCIENCES(中国科学E技术科学)转载自《中国科技论文统计与分析》(中国科学技术信息研究所,2002年12月)第104页