燃料乙醇生产中低聚糖及有机酸的HPLC分析及应用效果

化学与生物工程2015,V,32№.07Www.hxyswgc.comChemistry Bioengineeringdoi:10.3969/j.issn.l672-5425.2015.07.018燃料乙醇生产中低聚糖及有机酸的HPLC分析及应用效果郑伟,杨维旭,李冬梅,谭洪波,刘春景,孔令新(吉林燃料乙醇有限责任公司,吉林吉林132101)摘要:在燃料乙醇生产过程中,采用高效液相色谱(HPLC)对低聚糖及有机酸进行监测;探讨了HPLC法的跟踪效果,并对有问题的发酵结果进行了分析。结果衷明:对发酵液开展HPLC检测,在生产工艺的优化及决策上效果理想,可满足过程监控的需求。关键词:燃料乙醇;低聚糖;有机酸;发酵液;糖化酶;酵母;染菌中图分类号:TQ9230657.72文献标识码:A文章编号:1672-5425(2015)07-0067-04在燃料乙醇的生产中,成熟的发酵技术就是严格菌对酵母产生的竞争性抑制上,效果较为理想,为生产的过程控制,体现的是从低聚糖到发酵产物并形成有工艺的优化及决策提供了更为科学的数据依据。机酸的过程,而过程控制的实现,需要对过程参数进行合理选取和有效监测。其中低聚糖及有机酸的监测是1实验掌握生产中通过酵母的发酵将糖转化为乙醇的必备手1.1试剂及仪器段;组分能够被及时准确的检测,可充分表达发酵工麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖、乳酸锂、丙三醇、醋酸序运行状态,对避免染菌、使乙醇收率最大化起到指导钠、无水硫酸钠、乙醇,均为色谱纯, Sigma Aldrich化性作用。学公司2。在燃料乙醇的生产上,国内仍沿续着常规的化学Lexar LC10系统, Perkin Elmer公司,软件方法监测工艺过程,对发酵工艺指标还局限在还原糖、 Chromera Manager Ver4.1.0.6386, phenomenex挥发酸残总糖的层面上,而国外(如美国 Corn Plus REZEXM ROA Organic Acid色谱柱(300mm×7.8及 Renew Energy燃料乙醇公司)已采用高效液相色mm,8gm),AJO4490预处理柱(50mm×7.8mm,谱(HPLC)法分析,是对发酵过程更为精细化和最为8m)。直接的分析方法;通过测定低聚糖[DP(低聚糖4-101.2方法糖)、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖]、有机酸、醇(乳酸和丙1.2.1低聚糖及有机酸标准样品浓度三醇、醋酸)、发酵目标产物(乙醇)等含量,可非常直观分别准确称取8种标准品置于100mL容量瓶地表达工艺中各罐的发酵状况,最终确定工艺参数。中,用流动相(0.0025mol·L-1H2SO4)溶解并定容,这些精细化指标对工艺的运行条件更为具体实用,这配制成标准品系列溶液及混合标准品溶液;混合标准不仅仅是检测仪器或分析方法的提升,更是对生产品溶液浓度见表1。艺管理的促进。1.2.2样品预处理吉林燃料乙醇有限责任公司质检中心自2004年为避免酶解及发酵的持续进行,需检测发酵醪液起,参照 Cerestar、 Corn Plus及 Renew Energy公司的的初始pH值。用65%H2SO、将醪液pH值调至1.0检测方法,对发酵醪液开展了HPLC的全程监测,在1.5,4000r·min-1离心5min。取上清液50mL,合理控制糖化酶用量、发酵温度,避免酵母抑制以及染定容到100mL,0.22pm水系滤头过滤至色谱样品瓶收稿日期:2015-0305作者简介:郑伟(1965-),女,吉林省吉林市人,硕士,高级工程师,主要从事燃料t H中国煤化工wjfa@cnpc.comcn;通讯作者:杨维旭,高级工程师,Emal:yangwx.jfa@cnpc.com.cnCNMHG郑伟等:燃料乙醇生产中低聚糖及有机酸的HPLC分析及应用效果/2015正鼻7用表1低聚糖及有机酸混合标准品溶液1.2.3色谱条件浓度/g·(100mL)-1]流动相为0.0025mol·LH2SO4,流速0.6mLTab. 1 Concentration of oligosaccharides and organic·min1,柱箱温度65℃,RID温度50C,进样量20acid mixed standard solutionL,运行时间25min样品名称浓度样品名称浓度1.2.4低聚糖及有机酸定性、定量方法无水硫酸钠乳酸锂先以保留时间、样品加标来进行定性;再以峰面积麦芽三糖丙三醇外标法定量。麦芽糖醋酸钠葡萄糖乙醇2结果与讨论注:定量时将无水硫酸钠的量乘以0.8即为DP的量。2.1低聚糖及有机酸标准曲线的回归方程和线性范中,自动进样,进行HPLC分析。围(表2)表2混合标准品溶液的回归方程和线性范围Tab 2Regression equation and linear range of mixed standard solution回归方程相关系数线性范围样品名称截距Y斜率Xg·(100mL)-11.88384e+0023.109764e+0030.9996162.732~16.620麦芽三糖3.20229e+0003.768599e+0030.9972520.476~0.953麦芽糖5.727923e+0012.85678le+0030.9997691.075~5.957葡萄糖1.097297e+0022.935999e+0030.9999303.35~10.93乳酸2.554407e+0012.073031e+0030.9958180.10~0.583.982963e+0012.277596e+0030.9996910.52~1.56醋酸4.502039e+0011.629429e+0030.996860乙醇3.001877e+00l1.225771e+0030.9999982.05~15.502.2燃料乙醇生产中发酵液的液相色谱(图1)联合作用下异构生成。发酵液中重点关注的组分DP(低聚糖4-10糖,合峰)、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖、乳酸、丙三醇、醋酸、乙醇2.3HPLC对发酵过程的跟踪应用首先,在发酵早期监控DP分布,可让工艺人员0.75了解淀粉酶将淀粉转化成可发酵糖的程度,并确定投0.502MA八酵母的具体时间。其次,后面出峰的组分(乳酸、丙三醇、醋酸和乙醇)代表在发酵期间所产生的有机酸和乙0.02.55.07.510.012.515.017.520022.5醇。监控这些组分,可便于工艺人员确认发酵终点;并图1发酵液的HPLC图谱指导工艺人员添加严格控制的限量抗生素,来抑制细Fig. 1 HPLC Spectrum of fermentation liquid菌的污染,及防止其它可能导致抑制乙醇生产的情况由图1、表2可知,发酵液中各组分分离度较好,发生含量线性范围涵盖合理,相关性较高满足方法的适用2.3.1理想的发酵状态性要求。利用HPLC监测发酵过程,理想的发酵结果见表在对发酵液进行HPLC分析时,组分中会分离出其它的发酵产物;其中,阿拉伯糖、丁二酸、甲醇系发酵在进行HPLC分析的同时,将HPIC的分析结果过程中正常产物,对发酵影响不大;果糖系液化过程中同发酵温度H中国煤化工奉相结合,对燃料淀粉链还原端的一些葡萄糖单元在高pH值和高温的乙醇生产具CNMHG郑伟等:燃料乙醇生产中低聚糖及有机酸的HPLC分析及应用效果/2015正■7睏表3理想的发酵结果Tab. 3Data of ideal fermentation发酵时间温度浓度/g·(100mL)1乙醇体积分数hC“胞数出芽率DP麦芽三糖麦芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇2080.8075.8760.0430.0141.863.42360.5748.4590.0720.0143.143.892233.52146.460.1801.196.1140.0761.280.0197.4833.42490.2493.7240.0921.330.03010.380.1320.450.0930.03212.9015.9933.30.740.0900.420.1110.0951.400.04313.4416.662.3.2有问题的发酵结果发酵结果见表4~7。利用HPLC对发酵过程进行跟踪分析,有问题的1)糖化酶用量表4有问题的发酵结果1Tab 4Problem fermentation data 1发酵时间温度浓度/[g·(100mL)-1乙醇体积分数麦芽三糖麦芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇%5.8760.0430.01433.2152,850.0890.0251.912.372233.312.941.843.031.420.0950.0313.844.76分析表4结果可知,发酵过程存在的问题为较高是发酵过程中糖化酶添加量不足。因此,在发酵罐中的DP值、较高的葡萄糖值、乙醇产率低。原因可能应再添加一些糖化酶。表5有问题的发酵结果2Tab. 5Problem fermentation data 2发酵时间出芽率浓度/[g·(100mL)1乙醇体积分数活细胞数%DP麦芽三糖麦芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇937.720.8075.425.8760.0430.670.0141.862.300.71013.5700.0721.020.0144.480.3801.8910.8400.1901.410.0247.599.4132l85831.230.1900.806.8900.3401.500.0419.1011.28分析表5结果可知,发酵过程存在的问题为较快多,较高的葡萄糖浓度造成对酵母的渗透压过高。因的DP水解速度、早期有较高的葡萄糖数值、较高的此,应减少糖化酶的用量。丙三醇和有机酸数值。原因可能是添加的糖化酶过2)发酵温度有问题的发酵结果Tab. 6Problem fermentation data 3发酵时间温度C胞数出芽率浓度g·(100mL)-1乙醇体积分数%DP麦芽三糖芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇32.22017.726.9120.043790.0141.121.768.940.5443.799.5600.0970.980.0202.643.2735.62140,1701.19H8.360中国煤化工7,18CNMHG郑伟等:燃料乙醇生产中低聚糖及有机酸的HPLC分析及应用效果/2015年鼻7厢分析表6结果可知,发酵过程存在的问题为较高率和活细胞数。原因可能是发酵温度过高造成酵母生的发酵温度、较慢的酵母利用葡萄糖的速率、较高的丙长受抑制。因此,应采用较低的发酵温度32~33℃。三醇数值、低的乙醇产率、较高的有机酸、较低的出芽3)染菌表7有问题的发酵结果4Tab. 7Problem fermentation data 4发酵时间出芽率浓度/[g·(100mL)-1]乙醇体积分数活细胞数h麦芽三糖麦芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇2087.720.8075.425.8760.2500.670.0291.862.300.5743.798.4590.1200.910.0192.842140.1801.196.9100.1701.440.0355.60199882.280.2490.434.9600.3901.550.0487.949.85分析表7结果可知,发酵过程存在的问题为较慢淀粉在整个乙醇生产工艺的水解程度和水解产物特的葡萄糖利用效率、较高的有机酸、较低的乙醇产率、性,能更直观地表达发酵过程中各罐的发酵状况;为掌较低的出芽率和活细胞数。原因可能是染菌造成对酵握酶作用底物效果,酵母的充分利用等生产运行状态,母的竞争性抑制。因此,在酵母培养和发酵罐中应添确定合理工艺参数,避免罐内物料染菌,提高转化率,加抑菌剂可以起到很好作用效果,是生产、工艺管理者及操作者3结语理想的控制资料和数据,具有重要的指导价值和现实意义1)通过HPLC法对燃料乙醇生产中的发酵液进参考文献:行低聚糖及有机酸的检测分析,是过程控制的最为有1 MCGINLEY M,MOTT. Ethanol Production Monitoring Using效的手段,其多组分分离的方法直观、简便、快速、准lon Exclusion hplc.2]杨毅,李崎,陈蕴,等.反相高效液相色谱法(RP·HPLC)测定啤酒确;为生产装置平稳运行提供了准确数据信息,实现了中有机酸[门].食品与发酵工业,2003,29(8):6-12.过程质量管理及控制的动态分析。[3]刘文信.HPLC在酒精发酵醪液检测中的应用[J].化学工程师2)依据HPLC检测发酵不同时间段数据的累积013,(2):28-30可有效掌握液化糖化工序、酶作用底物的效果,了解HPLC Analysis and Application Effect of Oligosaccharides andOrganic Acid in the production of Fuel ethanoZHENG Wei, YANG Wei-xu, LI Dong-mei, TAN Hong-bo, LIU Chun-jing, KONG Ling-xin(ilin Fuel Alcohol Com pany Limited, Jilin 132101, China)Abstract: The content of oligosaccharide and organic acid in the production process of fuel ethanol was de-termined by high performance liquid chromatography(HPLC). The tracking effect of hPlc was discussed, andthe problem of fermentation data were analyzed. The results showed that, HPLC analysis of fermentation liquidwas ideal in the production process optimization and decision making, and met the requirements of process moniKeywords: fuel ethanol; oligosaccharides; organic acid; fermentation liquid; saccharifying enzyme; yeast: bac-terial contamination中国煤化工CNMHG