乙烯受体与果实成熟调控

园艺学报2004,31(4):543 ~548lcta Horticulturae Sinica乙烯受体与果实成熟调控魏绍冲’陈昆松'* 罗 云波(!浙江大学果实分子生理实验室,农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室,杭州310029;2中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083 )摘要:综述了有关乙烯受体和果实成熟衰老研究的最新进展,主要包括拟南芥乙烯受体和信号转导,番茄等果实乙烯受体家族基因的表达与功能研究,果实乙烯受体基因表达的调节等,对今后乙烯受体的相.关研究前景作了展望。乙烯受体转基因等研究结果表明,乙烯的作用可以在受体水平实现高度调节。关键词:果实成熟;乙烯受体;信号转导;综述中图分类号:S601 ; Q 946文献标识码: A文章编号: 0513-353X ( 2004 ) 04-0543-06 .Ethylene Receptor and Its Regulation in Ripening FruitsWei Shaochong' , Chen Kunsong', and Luo Yunbo2( ' Laboratory of Fruit Molecular Physiology and Biology , Zhejiang University ; The State Agriculture Ministry Laboratory of Horti-cultural Plant Growth , Development and Biotechnology , Hangzhou 310029 , China ; 2 College of Food Science and Nutritional En-gineering , China Agricultural University , Beijing 100083 , China )Abstract : The action of plant hormone ethylene is finally realized through ethylene receptor and its sig-nal transduction. The latest advances in researches on the ethylene receptor and fruit ripening is reviewed inhe present paper. The main contents include : the ethylene receptor and its signal transduction in Arabidopsis,and the expression of ethylene receptors in relation to their functions in ripening fruits. Meanwhile , the pros-pect of ethylene receptor is predicted as well.Key words : Fruit ripening ; Ethylene receptor ; Ethylene signal transduction ; Review植物激素乙烯对植物生长发育的许多过程,如种子萌发、幼苗生长、开花、结实、果实成熟和衰老等有着广泛而深远的影响'。乙烯也是-个植物适应环境变化的信号,它调节了机械伤和病原反应等胁迫反应(2,32。Bradford 等4认为植物激素信号可以通过内源水平及组织对其感受进行调节,例如,果实对乙烯的敏感性可随成熟进程不断在发生改变。通过控制乙烯的感受仍可使果实成熟的相关变化延缓或中断'5。乙烯的生物合成途径已经于20世纪70年代末被明确, ACC合酶( ACS)和ACC氧化酶( ACO)是乙烯生物合成的两个关键酶。研究表明, ACS和ACO均由多基因家族编码,这些基因对不同发育信号和环境刺激产生响应,从而有效地调节植物乙烯的生成与作用06-8)。随着乙烯研究的不断深入,人们开始逐渐转向乙烯感受和信号转导途径的研究。通过拟南芥乙烯反应不敏感突变体的分析,人们分离得到了一系列关键基因,并进行了大量的分子遗传学分析,建立了拟南芥的乙烯信号转导途径初步轮廓(9。10]。本文综述近年来乙烯受体研究的新进展及其在果实成熟衰老进程中的调控途径。1拟南芥乙烯 受体和信号转导中国煤化工以黑暗条件下乙烯对幼苗的”三重反应” (即黑暗.MHC NMH G;在乙烯存在的条件下收稿日期: 2003 -09-20;修回日期:2003-11-06基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目( 973项目) ( G2000046806 );国家自然科学基金项目( 30270917 );浙江省自然科学基金重点项目( ZD0004 )*通信陌方数据for corespondence ( E-mail : akun@ zju. edu. en)544园艺报31卷发生表型变化,包括下胚轴膨胀变短,顶端钩状芽弯曲加剧，茎杆偏向水平生长)作为筛选手段,人们从拟南芥中分离得到了许多乙烯合成和信号转导发生改变的突变体"1),随后CTR112),EIN2[13) , EIN314), ERF115) , ETR1'16)等多个乙烯信号转导相关基因相继被克隆。值得注意的是ETR1显性等位基因突变体的克隆,导致了番茄中包括NR在内多个乙烯受体基因类似物的确定[7。ETR1蛋白与原核生物中普遍存在的双组分系统高度同源,它主要位于细胞的内质网中18]。在细菌中,由感受器和反应调节器组成的双组分系统起到调节各种发育和刺激反应的作用‘19]。遗传和生化证据均表明ETR1编码一个乙烯受体。ETR1 是以二聚体的形式存在,且在铜离子参与下表现出与乙烯具有高亲和性20-23)。拟南芥的ETR家族由5个受体蛋白组成24-26) ,其相应的编码基因分别为ETR1、ETR2、EIN4、 ERSI 和ERS2。拟南芥乙烯受体蛋白从功能上可分为感受器、组氨酸激酶和反应调节器3个结构域(27)。(1)感受器(Sensor)结构域:由3个疏水的跨膜节段组成。该区域高度保守,现在已知的所有引起乙烯不敏感的受体突变位点都处于这一区域,在乙烯不敏感的突变体(如etr1-1 )中,乙烯不能与受体蛋白结合。在这-结构域的N末端中含有形成二聚体和结合铜离子必须的氨基酸。(2)组氨酸激酶(Histidinekinase,HK)结构域:它比同源的细菌双组分系统中的HK序列大。激酶结构域由五个被称为催化中心(H,N,Gl,F,G2)的亚结构域组成。在ETR1和ERS1中包含所有的五个亚结构域,而ETR2、EIN4 和ERS2三个乙烯受体中缺少一个或多个亚结构域。ETR1 在体外可检测到HK的活性[28] ,这是目前唯-表现HK活性的乙烯受体。理论上讲, HK结构域在乙烯信号转导中起着向下游传递信息的作用。但是-个明显的问题是,既然有的受体中不具有HK活性,那么,它们又是如何进行信号转导的,仍不清楚。(3)反应调节器( Response regulator)结构域:这-结构域中具有自我磷酸化的Asp残基。与细菌相类似,植物的乙烯受体家族的一些成员中缺乏这-结构域,如拟南芥中ERS家族成员ERS1和ERS2 ,而ETR1、ETR2 和EIN4则包含有反应调节器结构域。根据基因敲除( knock-out )对表型( phenotype )影响试验结果得出的模式推测(29) :在无乙烯的状态下乙烯受体应该是有活性的，下游的CTR组分也具有活性,而此时乙烯诱导的相关基因表达处于被抑制状态;当乙烯与受体结合时会使受体及CTR失活,乙烯诱导基因表达的抑制作用也相应被解除。然而,因为ERS2类受体无HK活性,所以受体活性的精确调节目前还不清楚。2果实乙烯受体研究进展.2.1番茄乙烯受体家族番茄是研究乙烯反应和果实成熟衰老的模式植物。目前,番茄的6个乙烯受体基因( LeETRI ~6)已分别被分离和定性‘30-37]。其中LeETR3 (即NR )基因定位在番茄的9号染色体上,序列分析发现Nr(Neverripe)突变体只是由于NR蛋白36位上单个碱基突变而使Pro变成Leu造成的(37]。Nr突变体除果实不能正常成熟外,还显示出乙烯不敏感突变株的多效突变效应,具体表现为:不表现乙烯的三重反应,叶柄不易脱落,叶和花瓣衰老进程明显推迟(37]。研究表明,番茄乙烯受体( LeETR )家族的结构与拟南芥乙烯受体家族十分相似,但番茄乙烯受体的各个成员在蛋白质水平上差别较大,在序列.上表现出50%以下的同源性,其中从LeETR4和LeETRS两个成员的序列中推测似乎存在第4个跨膜结构域,这个结构域可能是-个信号序列或者起中国煤化工接传递到细胞质的作用。其中NR受体蛋白缺少接受器结构域, LeETR4 ~6YHCNMH宅整的HK结构域。尽管各番茄乙烯受体的结构有显著差异,但试验已证明除克隆较晚的LeETR6外, 其它均已被证实为乙烯受体,因为它们都已被确定有结合乙烯的能力38。2.2番茄乙烯受体基因的表达 与功能研究当考虑受体表达对调节整个乙烯反应的重要性时,需注意以下几点。首先,乙烯受体在信号转导3期魏绍冲等:乙烯受体与果实成熟调控545过程中显然是作为负调节因子起作用。在缺乏乙烯的情况下,受体会抑制乙烯诱导的相关基因表达。根据这种模式推测组织对乙烯的敏感性与受体水平之间呈负相关关系。要解除抑制,应当需更多的乙烯使受体失活,反之亦然。另一个需考虑乙烯反应的因素是受体有一个较长的与乙烯分离的半衰期，酵母中表达的ETR1测定的半衰期大约是12 h(20]。 这意味着受体一旦与乙烯结合,它将在较长的一段时间内不能抑制乙烯诱导的相关基因。无论是在果实发育中或外界刺激下，番茄中的多个乙烯受体基因的表达发生明显改变。当乙烯反应启动时,乙烯合成的快速增加会伴随受体合成的增加。通常当-种植物激素的合成增加或施加某种激素,植物会迅速作出反应以降低或解除这种反应,包括通过酶的合成直接消除激素的作用。例如,对拟南芥使用生长素可以导致生长素结合酶活性的增加59]。对于乙烯,还不知道会使哪些酶变化,因为它比较容易扩散。由于直到最近其它植物激素的受体基因才被克隆,所以还不知道其它激素的受体在激素增加时是否会出现同样情况。2.3乙烯受体基因的表达与番茄果实成熟调节番茄乙烯受体基因在果实发育过程中表现出不同的表达模式。LeETR1 和LeETR2在不同发育时期所有组织中的表达基本保持不变,同时它们的表达不受乙烯诱导调控,这说明它们可能与果实成熟关系不密切。相比之下,其余4个基因( LeETR3 ~6)的表达模式则是受乙烯和果实发育高度调节的38。在果实成熟过程中,盛花期子房的NR mRNA具有高水平的表达,随后趋下降,到果实成熟期其表达水平是子房的20倍(34)。LeETR4 , LeETRS和LeETR6在生殖器官(花和果实)中表达丰富,而在营养器官中表达水平较低(38)。目前对这些受体基因在生殖器官中的显著高表达所产生的功能还不清楚。近年来,人们还从番茄中分离得到了乙烯信号转导下游CTR1 , EIN3 , EREBP ( ERF1 )等组分同源的相关基因。Lin等'40]克隆了TCTR2,它与CTR1蛋白有41%的同源性。Zegzouti等41)分离得到了ER50 ,其编码另一个与CTR1相似的蛋白，并推断可能有多种MAP3K参与了乙烯作用的调节。TCTR2是组成型表达的，不受外源乙烯的诱导(40);而ER50 mRNA则在果实成熟过程中正向调节( up-regulated),并受外源乙烯的诱导(41。Alexander 等(42)认为, 番茄乙烯受体可以和与Raf蛋白激酶相似的LeCTR的至少5个家族成员直接作用。此外, Gu等43)还从番茄中分离得到了EREBP的类似物pti4。Tieman 等' 44从番茄中筛选到EIN3基因的类似物LeEIL1 , LeEIL2 , LeEIL3基因。结合拟南芥和番茄乙烯信号转导的研究结果,我们对乙烯受体基因的表达与果实成熟关系有了初步认识,即乙烯与膜上受体蛋白的结合会使乙烯受体及CTR失活，下游的EIL和EREBP等组分则被激活,引起一系列成熟相关基因的表达,最终导致果实成熟;而在受体蛋白不与乙烯结合的情况下,乙烯受体和CTR是具有活性的,下游EIL和EREBP组分被抑制不表达,果实不能正常成熟。但番茄果实在成熟阶段发生对乙烯的敏感性与果实中乙烯受体基因的表达模式并不是-致的,相关调节模式还需要进-步试验证实。2.4其它果实乙烯受体的研究尽管不同植物中乙烯受体有较大差异,但其编码基因序列中仍存在相对保守的区域,特别是在其蛋白质N-端与乙烯结合的结构域。除番茄外,人们已相继从香瓜(45)、西番莲46.47、 桃48.49)、香蕉(S0)、口果5、苹果'52]、梨s3.54)、柑橘55、黄瓜[S0]等果实中分离得到了多个乙烯受体同源基因。目前研究结果表明,乙烯受体基因在这些植物中也可能中国煤化工在。例如，香瓜、西番莲、桃等果实中目前均已分别分离出了两个以上的乙MHC N M H G研究的深入，可能每一种果实中将会有更多的乙烯受体基因不断被克隆。不同类型果实的乙烯受体基因的表达是复杂多样的,在西番莲和桃果实中, ETR类型受体基因PeETR1和Pp-ETR1在果实发育和成熟过程中是组成型表达,与番茄果实中的LeETR1和LeETR2表达相似,基本不受乙烯生成的影响;但是在香瓜和口果果实中,瓦夜葵型受体基因Cm- ETR1和METR1的表达水平则随果实成熟进程推进及乙烯合成能力增546艺报31卷强而增加。可见,乙烯受体基因在各种果实中可能存在不同的表达和调节模式。2.5果实乙烯受体基因表达 的调节2.5.1受体基因表达的调节途径 果实乙烯受体基因的表达受发育成熟度及果实部位、乙烯、乙烯受体抑制剂等因素调节。魏绍冲等(57)对不同成熟时期番茄果实不同部位的LeETR4表达模式研究表明,LeETR4在番茄外果皮中的表达水平明显低于果实的辐射壁和中柱部位。乙烯对各乙烯受体基因表达的影响不一,已在前述番茄果实的基因表达部分中提及。乙烯作用抑制剂与乙烯竞争受体结合位点，阻止组织对乙烯响应,其对果实中各乙烯受体基因的表达影响不同。Nakatsuka 等[58)用1 -甲基环丙烯( 1-MCP )处理转色期番茄果实,发现果实中NR mRNA累积受阻,果实成熟推迟,而另一-受体基因eTAE1 ( LeETR1 )的表达基本没有改变; 1-MCP处理对桃果实的Pp-ETR1表达没有影响,但对Pp-ERS1表达起到抑制作用49)。2.5.2调节乙烯受体基因表达的基因工程通过调节乙烯受体基因的表达水平调控果实的成熟衰老进程,是实现生物技术延缓果实后熟软化的一个重要途径。目前,番茄乙烯受体的多种转基因植株已获得成功,但在其它果实中未见成功的报道。Wilkinson 等' 59)将拟南芥乙烯受体基因ETR1-1突变序列转入番茄中,发现能明显推迟果实后熟及花的衰老。Ciardi等'60)通过连接组成型表达的35S启动子的NR eDNA获得过量表达NR的转基因植株对乙烯敏感性降低(61]。这些结果与拟南芥中的研究结果完全吻合,表明乙烯受体系统存在-定程度过剩。但是减少LeETR4的表达对植株影响严重,呈现出乙烯组成型反应,表现在叶偏上性,花瓣脱落和果实成熟提前等'61。而当这些影响发生时,乙烯生成并没有增加,说明这些反应与乙烯受体表达水平发生改变有关。转基因植物中受体基因表达的研究揭示了乙烯受体之间可能存在功能补偿( functional compensation ),当反义控制NR的表达后, LeETR4的表达则相应提高,植株通过某种方式增加LeETR4的表达以补偿NR表达的降低,因此NR反义植株整体的乙烯受体水平并未受明显影响。Whitelaw 等62采用反义手段抑制番茄LeETR1的表达后,研究表明反义植株的叶片中NR表达水平以及果实的着色和硬度基本未受影响,但植株的节间变短,花的衰老延迟。Hackett 等(63)反义抑制了Nr突变体植株中的NR基因表达后, 果实恢复了成熟能力,这在证明乙烯受体是负调控的同时,也表明NR可能并不是果实正常成熟所必需的。总之，这些转基因研究结果将有助于我们更正确地认识各个番茄乙烯受体基因的功能以及它们之间的相互关系。3展望乙烯的生理作用最终是通过乙烯受体及其信号转导过程完成的。目前,番茄乙烯受体研究已经较为深入,借助番茄乙烯受体的研究成果继续开展其它果实乙烯受体的研究将是今后乙烯作用研究的一个新热点。随着果实成熟生理及乙烯受体研究的深入,相信从乙烯受体水平上调控果实成熟进程的基因工程不久将会应用于生产实践,并可望产生巨大的经济和社会效益。此外,乙烯的作用并不是独立的,还需要其它激素的配合,因此要全面了解乙烯的作用,需要从分子生物学水平上对植物生长发育过程中乙烯与其它植物激素的关系,特别是结合信号转导开展研究。目前许多学者已开始致力研究ABA与乙烯信号转导的关系(64,65)。随着21世纪蛋白质组学时代的到来,乙烯受体及信号转导在果实发育等过程中蛋白水平的变化及其互作,如乙烯受体与CTR的相互作用等,将是未来研究的一个重要方向。中国煤化工参考文献:MHCNMHG1 Abeles F B , MorganP W，Saltveit Jr M E. 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