一种新型枝化聚乙二醇的合成

2007年第15卷合成化学Vol.15,2007第2期,216~218 Chinese Journal of Synthetic ChemistryNo.2,216~218·快递论文一种新型枝化聚乙二醇的合成王孝杰,李效东,刘克良2(1.国防科技大学航天与材料工程学院湖南长沙4100732.军事医学科学院毒物药物研究所北京100850)摘要:以谷氨酸作为中心分子首先对谷氨酸的氨基进行Boc保护然后在4二甲基氨基吡啶-二环己基碳二亚胺催化体系的作用下将两条线性的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)链连接到谷氨酸的两个羧基上合成出含有两条聚乙二醇PEG)链及一个活性氨基的新型枝化 PEC Glu(PEG)2]其结构经HNMR,IR,GPC和VPO表征。关键词:枝化聚乙二醇;活性氨基;氨基保护;合成中图分类号:0623.4;063文献标识码:A文章编号:1005-1511(2007)02-0216-03 Synthesis of Novel Branched Polyethyle Glycol WANG Xiao-jie', LI Xiao-dong', LIU Ke-liang? 1. College of Aerospace and Material Engineering National University of Defence Technology Changsha 410073, China 2. Institute of Pharmacology Toxicology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, China Abstract: novel branched polyethylene glycol[Glu(peg)2], which consists of two PEG chains and glutamic acidglu) with active amido protected by t-butyloxycarbonyl-(boc), was synthe- sized. Two linear PEG chains in Glu( PEG were linked up through two carboxylic group of the Glu by using 4-dimethylaminopyridine -dicyclohexylcarbodiimide as a catalytic system. The structure of Glu( PEG )was confirmed by'H NMR, IR, GPC and VPO. Keywords: branched PEG; active amido; amido protected; synthesis在当今的药物传送领域聚乙二醇(PEG)修具有特殊结构的PEG被称为枝化PEG+1。和线饰是一类被广泛使用的重要方法特别是在改善性PEG相比枝化PEG不仅可以最大限度地保蛋白质及多肽药物的临床应用方面被认为是目前留被修饰后药物的生物活性5,而且其特有的最成功的技术之一1-3。该技术在实际应用中存“类伞型结构可以更有效地保护蛋白质在体内在一些问题主要表现在蛋白质药物在PEG修饰不被水解能更有效地阻止抗体接近蛋白质药物,后通常会导致其生物活性大大降低。近年来的研从而大大增加蛋白质药物在体内的循环半衰期,究表明当采用一种具有特殊结构的PEG进行修同时大大降低其在体内的免疫源性781饰时,可以明显降低修饰后药物的活性损失这种目前国内外研究和使用的枝化PEG主要是收稿日期:2006-07-12第2期王孝杰等:种新型枝化聚乙二醇的合成217 NH2 NHBoc NaOH, THF/ Bu'-0 00-Bu'+ HO,,H Ho, co, H (Boc )0 Glu NHBoc mPEG, DCC-DMAP, CH, Cl2 >PEGO2CCO,PEG Glu( PEG) Scheme 1以赖氨酸(Lys)为中心分子的二枝化pG[ Lys ACROS公司叔丁氧羰基酸酐(Boc)2O]吉尔生(PEG)2 Lys PEG在修饰蛋白质时是以化4-二甲基氨基吡啶(DMAP)吉尔生化;二环蛋白质上的氨基作为修饰位点虽然通过氨基修己基碳二亚胺(DCC)吉尔生化;其余所用试剂饰蛋白质是迄今为止最常用的方法而且通常也均为国产分析纯试剂使用前经干燥处理。是在对蛋白质进行PEG化时被采用的首选方案,但这种方法也存在不足最突出的问题就是由于1.2合成蛋白质分子中可反应的氨基通常不止一个而使产(1)1的合成物中存在大量的异构体而这种异构体的混合物在烧瓶中加入Glu1.47g(10mmol)水10通常是很难分离纯化的。为此目前的PEG化技m,thf20ml及1moll-nao溶液10mL术在向着定点修饰”方向发展,即修饰剂只在指搅拌使其溶解后加入(Boc)202.6212mmol)定的位点发生反应。定点修饰不仅可以大幅度降于室温反应48h(反应中不断用1mol·L-1低产物中异构体的生成而且还可以通过设计蛋NaOH调节pH7~8)。反应液减压蒸馏至10白质分子上被修饰位点的位置来尽可能地保留其mL用1moll-hcl调pH2~3用乙酸乙酯药物活性。(3×20mL)萃取合并有机相用硫酸钠干燥减本文合成了一种新型的枝化PEG[Glu压蒸馏,真空干燥得凝胶状透明固体1,产率(PEG), Scheme]使用谷氨酸(Glu)作为中94%。心核分子通过Glu上的两个羧基连接两条线性(2)Glu(PEG)2的合成的mPEG链。Glu的氨基通过叔丁氧羰基(Boc)在烧瓶中加入11.0g(4mmol),mPEG6.0保护得1去保护后氨基可以方便地转化为马来8mmol),dC1.6g(8mmol)及dmap0.2g酰亚胺基团该基团对半胱氨酸上的巯基进行修(1.6mmol)搅拌下于室温反应5h过滤除去饰是蛋白质修饰化学中最有效的定点修饰手段之不溶物滤液经 mol Na2co3及饱和aCl12】作为后期修饰蛋白质时的反应位点。该方溶液洗涤硫酸钠干燥减压蒸馏真空干燥得白法合成路线简单,成本低,所得产物修饰特异性色固体 Glu PEG产率80%hnm8:1.44强具有很高的应用价值。相关研究国内外尚未(s,9h,H3),2.25(m,4h,ch2 of Glu),3.38见文献报道。(s,6H,OCH3),3.64(m,132H,OcH2CH2),4.28(s,4h,co2H2)1实验部分2结果与讨论1.1仪器与试剂 Varian INOVA--300型核磁共振仪(CDCl3为1和Glu(PEG)2的IR谱图见图1。由于1溶剂TMS为内标)Nicolet Mangna IR--550红有两个羧基所以在图1中的1715(C=0)c1外光谱仪(KBr压片) Waters1515-2414型凝胶处出现很强的吸收此峰在Glu(PEG中却消渗透色谱仪(简称GPC,THF为溶剂)KNAUER失表明1上的两个羧基反应了。而在GluK-7000型蒸汽压力渗透仪简称YP)(PEG)谱图中却出现了1740(C00)cm强吸218合成化学Vol.15,20071098cm-1处有较强的吸收,该处是醚键(C参考文献0-C)的伸缩振动吸收峰这是由于PEG链中存在大量的醚键导致的(1715,1603,120)[1] Harris Martin Modi. Pegylation novelcm-处的吸收分别是氨基甲酸(N-C-O)基团 process for modifying pharmacokinetic J ] Clin Phar- macokinet 2001 40 539-551.的对称及不对称吸收这一组峰是由Boc-HN产 [2] Kartre K. The conjugation of proteins with poly( ethyl-生的(1452,1362)cm-处的吸收为叔丁基的 ene glycol) and other polymers[j]. Adv Drug Deliv特征吸收是由Boc上的叔丁基引起的。所有的Rev9931091-114数据与枝化PEG的分子结构相吻合。 [3] Walsh G. Second-generation biopharmaceuticals[ J Eur J Pharm Biopharm 2004 58 185-196 GMPEG)2 [4] Monfardini, Schiavon O Caliceti,et al. branched monomethoxypoly( ethylene glycol) for protein modifica- tior{ J Bioconjugate Chem 1995 6 62-691 [5 Veronese F, Pasut G. PEGylation successful ap proach to drug delivery[ J ] Drug Discovery Today.2005101451-1458. [6] Veronese F M Caliceti, Schiavon 0. Branched and4000300020001000 linear poly( ethylene glycol J ] Bioactive Compatible v/cm-I Polym199712196-207图11和Gl(PEG)2的IR谱图 [7] Caliceti, Schiavon, Veronese F M. Immunological Figure 1 IR spectra of 1 and Glu PEG properties of usricase conjugated to neutral soluble pol-图2为Glu(PEG)2的GPC图。GPC谱图结 ymerd]. Bioconjug Chem 2001 12 515-522果表明产物中有两种物质其中主要产物的相对8】 Veronese Monfardini Caliceti et al Im provement of pharmacokinetic immunological and sta-分子量峰值为1995次要产物的相对分子量峰值 bility properties of asparaginase by conjugation to line-为927经分析其中主要产物是Glu(PEG)2次要 ar and branched monomethoxypoly( ethylene glycol产物为只连接了一条链的不完全产物。根据峰面 J] Control Release ,1996 40199-209积比例计算,Glu(PEG)2的含量为80%由于[9] Andrea, Michela, Chiara,etal. An improvedGPC所测得的结果是相对于聚苯乙烯(PS)的相 procedure for the synthesis of branched polyethylene对值所以所得结果与真实值之间存在一定的偏 glycols(pegs) with the reporter dipeptide met--ala差。过柱纯化后经VPO测试结果表明主要产物 for protein conjugation[ J ] Bioorg Med Chem Lett,的数均分子量为1783。由于原料mPEG本身的200212177-180分子量具有一定的分散度,所以所测结果与lu0 Caliceti Veronese Pharmacokinetic and bio(PEG)2的分子量(理论值为1712)较为吻合。 tein conjugates[ J ] Adv Drug Deliv Rev,2003,55:30.019951261-127720.011] Andrea, Mirta Michela,etal. Anchimeric assistance effect on regioselective hydrolysis of10.0 branched PEGS[ J ] Bioorg Med Chem, 2004,12:5031-5037.0.0 12] Roberts M, Bentley M, Harris J M. Chemistry4.08.012.018.020.0 for peptide and protein PEGylation J ] Adv Drug De- Minutes liv Rev200254459-576.图2PEG2的GPC谱图 Figure 2 GPC. spectrum of PEG2