聚乙二醇介导细胞融合的优化条件探究

第34卷湖北师范学院学报(自然科学版)Vol. 34第1期Journal of Hubei Normal University ( Natural Science )No. 1 ,2014聚乙二醇介导细胞融合的优化条件探究严镇钧',张小兵2(1. 湖北师范学院生命科学学院，湖北黄石435002;2.湖北省黄石市第十八中学,湖北黄石435001 )摘要;细胞融合技术是细胞工程中的一项核心基础技术，聚乙二醇(PEG)是最常用的促融剂,广泛地被应用于农业、医药环保等多个领域。探讨更符合细胞工程要求的、融合后的细胞更大限度地保持生理活性的.快速、有效的细胞融合条件。以牛红细胞为实验材料，PEG作促融剂介导牛红细胞融合,研究不同的融合温度、PEG作用时间、PEG的相对分子质量和PEG的质量分数等因素对细胞融合率的影响。实验结果表明,选择融合温度为39C,时间为15min,选用相对分子质量为2000、质量分数为45%的PEG,可以在细胞受毒害较小的同时得到最佳的融合效果,融合率能达到21.26%.关键词:细胞工程;聚乙二醇;使用条件优化研究中图分类号:Q813.2文献标识码:A文章编号:1009-2714( 2014)01-0014-06doi:10. 3969/j. issn. 1009 - 2714. 2014. 01. 004细胞工程是四大生物工程之- - - ,其核心基础技术之一是细胞融合 技术。细胞与组织不同,不排斥异类.异种细胞，因此细胞融合不受种属的局限,可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒,极大地扩大了遗传物质的重组范围;细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不象基因工程那样复杂,投资少,有利于广泛开展研究和推广,有着重大的实践意义。人工细胞融合开始于20世纪50年代,60年代到70年代作为一门新兴的技术发展很快,有力地推动了生物科学各领域的发展,目前,细胞融合技术已成为研究细胞遗传细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段,其应用范围极广,已在农业医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大,其发展前景及产生的影响日益显著。目前有许多促使细胞融合的技术,但有些技术还处于刚刚起步阶段，尚不成熟,或者存在某种生产应用方面的缺陷,例如利用灭活的仙台病毒介导细胞融合尽管可以得到较高的融合率,对各种动物细胞都适宜,并且仙台病毒能在牛胚中大量繁殖,但其缺点是操作复杂、不稳定,在保存过程中促融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐,而且病毒引进细胞后,可能会对细胞的生命活动产生干扰,正是由于这些缺点，目前灭活的仙台病毒已逐渐被聚乙二醇( Polyethyleneglycol , PEG)取代;利用激光融合技术虽然易于实现特异性细胞融合，参数易于控制,操作方便,而且实验重复性好,但它只能逐一-处理细胞,不能像PEG-样同时处理大量细胞”自从20世纪70年代Kao和Michayluk用PEG成A5十南石笊蚌物原生质体融合后2],PEG法介导细胞融合以其容易制备活性稳定、不需要中国煤化工便等优点，被普遍地YHCNMHG应用于生物、遗传、医药等研究领域,并且是目前应用取)以的细胞融口时促融剂。2009年,HuynhNT收稿日期:2013-10-23作者简介:严镇均(1976- ),男 ,湖北武汉人,讲师,研究方向为遗传学.●14.等利用聚乙二醇介导细胞融合技术发展了纳米医学中的一个新领域-脂质毫超微囊剂技术”。Oga-waF等用PEG介导经紫外线照射形成的肿瘤细胞和转人了IL-2基因或LacZ基因的树状细胞融合，融合细胞表达出了组织相容性复合体( Major Histocompatibility Complex , MHC ) classI、MHCclassll、CD86、CD11c和CD8alpha+。Dan K等用PEC介导细胞融合的技术证明了能高效抑制单纯疱疹病毒(HSV)复制的多金属氧酸盐PM-19并非是在病毒感染的融合阶段起作用”。另外,单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的,对生命科学的研究及医学方面的应用产生了重大影响,其中，PEG作为促融剂发挥了不可替代的作用,比如, Bhanuprakash V等用激活的淋巴细胞和骨髓瘤细胞通过PEG介导融合制造了蓝舌病病毒的单克隆抗体[°]。ChangheeYoo等用PEG(Mr=1500)介导经热处理后的前列腺癌细胞(DU145cells)和成熟的抗原呈递细胞树状细胞(Dendriticcells,DCs)进行杂交,制备前列腺癌细胞系疫苗。GuoCH等用50%PEG介导食管癌细胞系( esophageal carcinoma cell line 109 , EC109 )和树状细胞( Dendritic cells , DCs)融合产生抗肿瘤的杂交疫苗8。HommaS等用自体树状细胞和自体胃癌细胞通过PEG介导融合,使细胞产生抗体,再将融合后的细胞每两周--次地注射到严重胃癌的患者皮下,取得了有效的临床治疗效果9。总之,利用PEG作促融剂的细胞融合技术,已经得到了广泛应用,而在这些应用中，学者们采用的实验条件是不一样的目前，人们有时采用PEG介导融合技术和一些物理手段如激光融合技术相结合的方法，以进一步提高融合率。但是,影响PEG作用效果的因素较多,加大了获得理想细胞融合率的难度5。本文从融合温度、时间、PEG质量分数和相对分子质量等几个方面,对PEG应用于细胞工程中的最适条件做了探讨。1材料和方 法1.1材料Alsver液(pH7.4)、0. 85%生理盐水、GKN液、PEG(Mr = 600)、PEG(Mr= 1000)、PEG(Mr =2000). PEG( Mr =4000)、PEG( Mr = 6000)、健康牛静脉血。1.2方法1.2.1牛红细胞的获得取健康牛静脉血10mL至盛有40mLAlsver溶液的瓶中,混匀后置于4C冰箱,可保存一周。实验时取牛血1mL,移人10mL离心管,加入4mL0.85%生理盐水混匀,1200r/min离心5min;弃上清液,加0.85%生理盐水5mL,用指弹法将细胞团块弹散,混匀后1000r/min离心.5min,重复上述条件,再离心洗涤1次。收集最后1次离心沉淀的红细胞。1.2.2细胞融合温度的选择用血细胞计数法计数,将红细胞以预热的GKN液稀释成细胞密度为2x107/mL的牛红细胞悬液;分别取悬液1mL到5个试管中,每个试管加入0.5mL预热的质量分数为50%的PEG( Mr = 4000)混匀,将试管分别置于33C、35°C 、37C、39C、419C水浴中温浴15min;取融合后的细胞观察并统计融合率。1.2.3 细胞融合时间的选择 在最适融合温度下,分别温浴5min. 8min、13min、15min、17min,取融合后的细胞统计融合率。1.2.4 PEG质量分数的选择 在最适温度下，分别用质量分数为35%. .40% 、45%、50% .55%、60%、65%的PEG作为促融剂进行细胞融合,在最适融合时间取融合后的细胞统计融合率。1.2.5对PEG的选择在最适温度下,分别用最适质量分数的PFC(Mr=600)、PEG(Mr=1000)、PEG( Mr = 2000)、PEG( Mr =4000). PEG( Mr =6000)1中国煤化工,在最适融合时间取融YHCNM HG1.2.6细胞融合率的计算每一-次计算融合率时观察统计5个视野。在显微镜视野内,计数观察到的所有细胞核数以及其中已经发生融合的细胞的细胞核数,计算已经发生融合的细胞的细胞核数占细胞核总数之百分比即为融合率。2结果与分析2.1 PEG 介导细胞融合条件的选择2.1.1细胞融合温度温度是影响细胞融合的重要因素。从实验数据可以看出，当温度不超过399C时,细胞的融合率随着温度的升高而增加,温度在39C时融合率达到最大值,为23.24%，继续升高融合温度,融合率呈迅速的下降趋势,当温度升至419C仅为17.75%(图1)。因此,融合温度选择在35°C ~ 399C.2.1.2细胞融合时间将细胞融合温度控制在39C,融合时间为15min时,融合率达到最大值25.45%，当继续延长融合时间时,融合率并没有随着时间的增加而增加,至17min时,融合率为25.34%(图2),并且随着时间的增加,视野中出现了越来越多的细胞破碎现象,表现为观察到的完整细胞越来越少(表1)。因此,融合时间选择在8 ~ 15 min.0↑大20。103335341131温度/C时间/ min图1温度对牛红细胞融合率的影响图2PEG作用时间对牛红细胞融合率的影响2.1.3 PEG 质量分数分别用不同质 量分数的PEG作为细胞融合的促融剂，结果表明,融合温度在39C ,融合时间为15min时,细胞融合的效率随着PEG质量分数的增加而升高(图3)。但是,PEG具有一定的毒性,且其质量分数越大对细胞的毒性越大,极大地影响了融合率和融合后细胞的存活率16),因此, PEG的质量分数选择在45% ~55%.2. 1.4 PEG的相对分子质量分别用Mr为600、1000、2000、4000、6000的五种PEG来进行比较研究,结果表明，在这几种PEG中,相对分子质量为600的PEG介导细胞融合的效率最低，只有14.55%，随着相对分子质量的增加,融合率也增加,到相对分子质量为4000时,融合率高达25.73%,当PEG的相对分子质量为6000时,融合率略微升至25.87%(图4)。考虑到PEG的相对分子质量越大,对细胞的毒性也越大,因此，PEG的相对分子质量选择在1000~4000.25p一◆+◆s福15f时15-5t55565300100020004006000PEG质量分数/%不同Mr的PEG图3不同的PEG质量分数对牛血细胞融合率的影响图4不同Mr的PEG对牛红血细胞融合率的影响2.2PEG介导细胞融合条件参数的优化和选择以融合温度、融合时间、PEG质量分数和相对分子质量分别为实验因子,每因子分别取3水平作正交实验。正交因素水平表见表1 ,结果见表2.水平A表1正交实验中国煤化工DPEG质量分数/% .PEG相对THCNMHG间/min458503740003916.表2 I9 (3" )正交实验结果AD融合率/%110.05.23. 57324. 19424. 425217. 47623. 93722.51823. 21920. 16K119. 2718. 9916. 9115. 89<221.9421.4222. 2223.34<321. 9622. 7623. 5423. 94R2. 693.' 776. 638.05最优水平A3B3C3D3从表2可以看出:对细胞融合率的影响最大的因素是时间,其次是温度,然后依次是PEG的相对分子质量和PEG的质量分数;所以,融合条件的最优水平组合是A3B;C3D3.最佳条件重复性实验结果见表3.表3最佳条件的重 复性实验平均值观察细胞数584545613570578融合数14913915814825. 5125.5025.7725. 9625. 69由表3知,最佳条件的重复性较好,故可确定最佳融合条件:温度为39C、时间为15minPEG的相对分子质量为4000、质量分数为55%,融合率为25.69%.但是，PEG的相对分子质量越大、质量分数越高,对细胞的毒性也就越大，而这两个因素相对而言并不是影响融合率的主要因素,所以,在实际应用中,可以在保证融合效果的前提下,尝试使用对细胞毒性较小的条件。由于PEG的质量分数相对于其他因素而言,对融合率影响最小，PEG的相对分子质量对融合率的影响也比较小，所以分别用A、A2代替A; B; Cs D3中的As,用B，、B2代替A; B3C3 D3中的B3,将所得融合率值与表3中理论最佳条件的融合率值进行卡方分析，结果见表4.表4选择条件的优化实验xA B,C3 D3融合率/%18. 7519. 2220.1418. 9319. 261. 609A2B3C;D3融合率/%.25.1024. 76中国煤化工:920. 023A; B, C; D3融合率/%17.0715. 17TYHC NMH G164. 316A3 B2C3 D3融合率/% .23. 5926. 2624.8825.2725.000.019由表4可知,P(A2 B,C3 D3) P(A B3 C3 D3)均大于0.05 ,故在实践中可用A2或A,代替A3.如果用A2代替,则可以获得较多的融合细胞;如果用A代替,则可以更大程度地减少对细胞的毒害,从●17.减少对细胞的毒害这一思想出发,用 At代替As更好。P(A3 B2 C3 D3)大于0.05,P(A; BI C3 D3)小于0.05 ,故在实践中如用BI代替B;则得到的融合率太低,而可用B2代替B3.所以,在实践上,细胞融合条件的一-种较理想水平组合宜为A B2 C, D3 ,重复性实验结果见表5.表5理想选择条件的重复性实验24平均值观察细胞数594545663551融合数131111143115125融合率/%22. 0520.3721.5720. 8721.26由表5可看到,该理想选择条件的重复性较好,故可确定在实践中的--种理想融合条件为温度为39C、时间为15min、PEG的相对分子质量为2000、质量分数为45%， 融合率为21.26%.3讨论融合率在一定范围内随温度的升高而增大,在39 C时最大,继续升高温度时不仅融合率下降,而且细胞状态不良。细胞融合的最适时间为15 min,但是随着融合时间的延长,融合率反而有所下降,这可能是因为PEG作用时间过长，对细胞毒害太大,导致了更多融合细胞变形甚至破裂所致。细胞融合率与PEG的相对分子质量及其质量分数成正比，但PEG的相对分子质量越大、体积分数越高,对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者,在以往实验时常常采用的PEG相对分子质量一般为4000和6000,质量分数一-般为40%~60%。尽管本实验在选择范围内所用的PEG当相对分子质量为4000,质量分数为55%时,融合率最高,但是时间、温度是影响融合率的主要因素,PEG的相对分子质量和质量分数是次要因素，在实际生产中，对主要因素选取使综合平均值最好的水平,对次要因素可以选取使综合平均值最好的水平,也可以选取细胞受毒害较小的水平进行最优水平组合。用45%的PEG( Mr =2000)取代55%的PEG( Mr =4000),同样也得到了很高的融合率21.26% ,而且对细胞的毒害更小，所以在生产实践中较宜选用45%的PEG( Mr = 2000),而不是55%的PEG(Mr=4000)。PEG介导细胞融合受很多因素的影响,只要控制好作用时间与温度,将PEG的质量分数、相对分子质量等调节到适当的范围，就能获得较高的细胞融合率。当然,对于不同种类细胞,其最适融合条件之间的差别还有待于进一一步研究探讨。参考文献:[1]Steubing R W, ChengS, Numajir I Y, et al. Laser Induced Cell Fusion in Combination With Optical Tweezers [ J]. TheLaser Cell Fusion Trap Cytometry ,1991, 12: 505 ~510.[2]Kao K N，Wetter L R. Advances in techniques of plant protoplasts fusion and culture of heterokaryocytes [A] 。Interma-tional Cell Biology, 1976 - 1977 [C] . Boson, MA, TheRockefeller University Press ,1977 : 216 ~224.[3] Huynh N T, Passirani C, Saulnier P ,et al. Lipid nanocapsules : a new platform for nanomedicine [J]. Int J Pharm, 2009Sep 11 ,379(2):201 ~ 209.[4]Ogawa F, linuma H, Iwasaki K, et al. Fusion vaccine therapy by IL -2 - gene - transduced dendritic cells and tumorcells[J]. Gan To Kagaku Ryoho ,2005 ,32(11):1580 ~ 1582.[5]Dan K, Miyashita K, Seto Y, et al. The menory efeet of hetu中国煤化工pereament on nection lyherpes simplex virus at the penetration stage [J]. PharmacolTHCNMHG[ 6 ] Bhanuprakash V，Hosamani M, Balamurugan V, et al. Producun aunur cnauavucisatin u munoclonal antibodies to blue -tongue virus[J]. Virol Sin,2011 Feb,26(1):8 ~18.[7]YooC, DoH A, JeongIG, et al. Efficacy of dendritic cells matured early with OK - 432 ( Picibanil)，prostaglandinE2, and interferon - alpha as a vaccine for a hormone refractory prostate cancer cell line [J]. J Korean Med Sci ,201018.Sep,25(9):1284 ~ 1290.[8]GuoG H, ChenSZ, YuJ, et al. In vivo anti - tumor efect of hybrid vaccine of dendrtic cells and esophageal carcinomacells on esophageal carcinoma cell line 109 in mice with severe combined immune deficiency [J]. World J Gastroenterol ,2008 ,14(8):1167 ~1174.[9]HommaS, Matai K, Irie M, et al. Immunotherapy using fusions of autologous dendritic cells and tumor cells showed ef -fective clinical response in a patient with advanced gastric careinoma [J]. J Gastroenterol ,2003 ,38( 10) :989 ~ 994.[ 10]Kao W J, Lee D. In vivo modulation of host response and macrophage behavior by polymer networks grafted with fibronectin - derived biomimetic oligopeptides: the role of RGD and PHSRN domains [ J]. Biomaterials ,2001 Nov ,22(21):2901 ~ 2909.[11]Kao W J, Lee D, Schense J C, et al. Fibronectin modulates macrophage adhesion and FBGC formation : the role ofRGD, PHSRN, and PRRARV domains[J]. J Biomed Mater Res ,2001 Apr ,55(1) :79 ~ 88.[ 12] Archer M, Rodrigues M L, Aurelio M, et al. Crystallization and preliminary x - ray diffraction analysis of beta - einna-monin, an elicitin secreted by the phytopathogenic fungus Phytophthora cinnamomin [J]. Acta CGrytallogr D Biol Crys-tallogr , 2000 Mar. ,56( Pt 3) :363 ~ 365.[ 13]Pontecorvo G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment [J]. Somatic CellGenet, 1975, Oct,1(4) :397 ~ 400.[ 14]Davidson R L, Gerald P s. Improved techniques for the induction of mammalian cell hybridization by polyethylene glycol[J]. Somatic Cell Genet , 1976 Mar,2(2):165~ 176.[ 15] Hopwood D A. Genetic studies with bacterial protoplasts[J] . Ann Rev Microbial , 1981 ,35 : 237 ~259.[16]徐承水,党本元现代细胞生物学技术[ M].青岛:青岛海洋大学出版社, 1995.A study on condition optimization ofcell - fusion with PEG as the RevulsantYAN Zhen-jun ,ZHANG Xiao-bing(1. College of Life Sciences ，Hubei Normal University ，Huangshi 435002 ，China;2. Huangshi No. 18 Middle School , Huangshi 435002 ,China)Abstract:The cell - fusion technique is a core basic technology ,as the most frequently revulsant ,PEG is widely used in manyfields such as agriculture 、medicine、environmental protection , and so on. To find a more effective and rapid cell - fusion meth-od that can answer for the cell - engineering needs which need the fused cells to keep more physiological activities betterhere, ox red cells were taken as the material，which were made to fuse induced by PEG , the author studied the effects of fu-sion temperature 、PEG role time、PEG molecular weight and mass fraction on cell fusion . The results showed that when the fu -sion temperature、PEG role time、PEC molecular weight and mass fraction was 39C、15min、2000.45% , respectively, the fu-sion frequency reached to the peak value at the same time that the poison to ellls was much less , and the cell fusion ratereached to 21.26% .Key words: cell engineering ; PEG ;the optimum use condition中国煤化工MHCNMHG19.