聚乙二醇化技术在药物转运系统中的研究进展

中国其科大学学报Journal of China Pharmaceutical University 2008 ,39(4) :379 - 384379●综述.聚乙二醇化技术在药物转运系统中的研究进展田法,姚文兵"(中国药科大学生命科学与技术学院,南京20009)摘要:聚乙二醇化技术又称为 PEG修饰技术,是目前分子变构化学中最重要的技术之一。经过近几十年的发展，PEG化技术不仅在蛋白质类药物的开发中得到普遍的应用,而且巳扩展到新型药物载体、控释制剂等各个领域。本文从.PEG化蛋白质类药物、PEG化疏水性药物、PEG化纳米共聚物给药系统以及PEG化脂质体等方面对近年来PEG化技术在药物转运系统中的应用及研究进展进行了综述。关键词PEG 化;聚乙二醇;化学修饰;药物转运系统中團分类号R914文献标识码A文章编号 1000 - 5048(2008)04 -0379 -06Advances in PEGylation in drug delivery systemsTIAN Hong, YAO Wen-bing"School of life Seience and Technology, China Pharmaceutical Unieriy, Nanjing 210009, ChinaAbstract: PEGylation, s0 called polyethylene glycol mdification or chemical modifcation, is one of the mostimportant technologies in molecular alosteric chemistry. In recent years, PEGylation has not only been applied inthe development of protein pharmaceuticals, but also been expanded to many new fields such as drug carriers andcontrolled-release preparations. The latest investigation and application of PEGylation in drug delivery systemincluding pegylated protein drugs, pegylated copolymeric micelles, pegylated liposomes, etc, were reviewed in thispaper.Key words PEGyaion; plyebhylene glycol; chemical modificatin; drug delivery sytemThis study was suported by the National Naturul Science Founndaion of China (No. 30772679, No. 30672559)聚乙二醇化( PEGylation)又称为PEG修饰,是学与生命科学的相互渗透与交融,给生命科学的研目前分子变构化学中最重要的技术之一。PEC化究带来了新的突破和重要的发展。本文就近年来技术的研究始于20世纪70年代, Abuchowski等第PEG化技术在这方面的应用及研究进展作一一次将聚乙二醇共价结合到蛋白质上,以保护蛋白综述。质免遭破坏，通过聚乙二醇修饰不仅可以增加蛋白质的水溶性,还能减少肾脏的清除,优化蛋白质的1 PEG 化的蛋白质类药物药动学和药效学性质。从此,国内外的研究人员开1990年PEC化的S-腺苷脱氨酶获FDA批准始关注用高分子化合物对生物大分子结构进行修上市,使PEC化技术开始真正走向市场。到2008饰,以克服蛋白质类药物在临床应用中的困难。经过几十年的发展, PEG化技术不仅在蛋白质类药年共有8种PEG化生物技术药物获得FDA批准上物的开发中得到普遍的应用,而且已扩展到新型药市(见表1) ,还有十几种药物处于临床或临床前研物载体控释制剂等各个领域"。这种高分子化究阶段中国煤化工收稿日期2008-01-16'通讯作者Tel:025 -83271375 E-mail:wbyeTYHCNMHG基金项目国家 自燃科学基金资助项目(Na. 30772679 ,Na.30672559)380中国巢科大学学报Journal of China Phamaceutcal University第39卷表1美国FDA 已批准的PEC化药物半胱氨酸的蛋白质容易形成聚合体,会给后续研究商品名有效成分生产公司适应证带来干扰。PECADA PEG-S-腺 昔脱氨酶Enon和ADA相关的免疫缺陷最近,伦敦大学的Brocchini等(4)设计出一种针综合症ONCASPAR PEG天冬酰胺酶Enzon急性淋巴细胞性白血病对二硫键的定点PEG修饰剂,使用这种修饰剂的方PEC-IFN PEC-IFNa-2bSchering丙型肝炎法包括两个步骤:首先,将蛋白质中天然存在的二硫NEULASTA PEG-G-CSFAmgen肿瘤化疗 后中性粒细胞键还原成两个巯基;然后,用一个连接有PEG链的PEGASYS PEC-IFNa-2a Roche 丙型肝炎三碳桥将两个巯基重新连接起来(见图1)。SOMAVERT PEC-生长激素Pize肢端肥大受体拮抗剂MacugenPEG抗VECF Pize年龄相关性黄斑变性disufide、抗体MircenPEG促红细胞Roche生成素βR-PEGprotein-随着PEG化技术的深入发展,早期直链、低相对分子质量、随机修饰的PEG化技术显现出一定Figure 1 lustrationo o disulide bridging PEGylation with a theecar的局限性,如:产物不均一、修饰后蛋白质生物活性bon bridge spanning the oniginal doulide bond降低等。为了克服这些缺点,近年来PEG化技术这种修饰剂可以对含有二硫键的各种细胞因呈以下几种发展趋势。子抗体、酶等天然蛋白质进行修饰,而不破坏蛋白1.1 定点PEG化试剂的发展随着PEG修饰技术的发展, PEG定点修饰已质空间结构和生物活性。此外,该研究聚乙二醇化经成为主要发展方向。一个恰到好处的修饰位点,技术在药物转运系统中的研究进展还显示,这种修不仅会使修饰后蛋白保留大部分原有活性,还会对饰过程中未被修饰的蛋白可以回收重新利用,从而随后的分离纯化工艺等带来便利。因此,人们开发提高修饰产率,使之可以用于大规模生产过程。出许多可以针对某些氨基酸残基的侧链或末端氨.2 分子生物学技术在定点修饰中的应用近年来,一种利用非天然氨基酸进行定点修饰基进行选择性修饰的定点修饰剂(23。醛基化的mPEG试剂是最常用的定点修饰剂。的技术也很值得关注。2002年,美国Scripps研究其主要原理是蛋白质N末端氨基的pKa要小于其中心通过对tRNA和氨酰tRNA合成酶的研究,构.他部位氨基的pKa值,如赖氨酸的g-NH2,在低pH建了一种正交的氨酰tRNA合成酶/tRNA系统。.值溶液中PEG乙醛( PEG-Aldehyde，PEG-ALD)与通过这套系统,非天然氨基酸可以与琥珀终止子N.末端氨基反应的机率远远大于与赖氨酸上的ε(UAG)、稀有密码子(AGG)等相对应,从而被定点引人到蛋白质中。这些非天然氨基酸可以带有炔NH2 ,故可以对N末端进行定点修饰。安进公司已基叠氮基等特殊基团,用于连接多糖生物素及各上市的Neulasta就是利用PEG醛对G-CSF进行N种PEG化试剂,从而达到高特异性的PEG定点修末端定点修饰的产品。这种修饰反应需要精确控饰的目的51。制反应条件,因为PEG醛对g-NH2的选择性虽然本课题组在国家自然科学基金的支持下,成功比较低,但还是可能形成- -些副产物。建立了一套可以将对叠氮苯丙氨酸定点引人到蛋采用马来酰亚胺或卤乙酸活化的PEG试剂可白质中的特异性表达系统,利用对叠氮基团和带有以选择性的对半胱氨酸侧链的巯基进行修饰,这种乙炔基团的聚乙二醇修饰剂进行反应,可以使修饰剂在特异性和反应效率上都比氨基的随机修PEG 高度特异性的定点到蛋白质的某- -位点(见饰剂要高,对没有半胱氨酸残基的蛋白质也可以通图2中国煤化工氨基酸侧链上没过基因工程在蛋白质非活性区域引人半胱氨酸用有可YHC N M H G团,因此避免了传于修饰。这种修饰方法存在的主要问题是,引人了统定点修饰中的一 些副产物的形成。第4期田法等:聚乙二醇化技术在药物转运系统中的研究进展381于水和毒性大限制了其在临床上的应用,通过PEG化技术将其制成前药,可以有效的解决上述-PEG问题。因此,现在越来越多的小分子药物也逐渐采用PEG修饰技术，并取得一定进展, 如:PEG-紫杉醇、PEC-阿霉素、PEG-阿糖胞苷等"”]。此外由于肿瘤选择性滞留(EPR)效应,很多抗肿瘤药物通过一PEGPEG修饰,能够达到肿瘤组织的被动靶向给药。H与蛋白质类药物不同,在小分子药物的PEG化研究中,最常用的是可释型PEG化技术( releas-Flgure2 Proiein deivtization with PEC through a copper meditedable PEGylation ,rPEG) ,PEG与药物的连接键能够eycladition reaction在体内按一定速度断裂,释放出有活性的原形.1.3 酶工程技术在PEG定点修饰中的应用药物。Neose Technologies公司6)开发了一种利用糖rPEG与药物通常以可水解的碳酸酯、氨基甲基转移酶将PEG修饰到蛋白0型糖基化位点的技酸酯或体内可降解的多聚氨基酸连接起来。例如，术。通过酶反应,大肠杆菌中表达的非糖基化蛋白通过不同的氨基酸把PEG分子连接在紫杉醇上,中的丝氨酸和苏氨酸残基被乙酰半乳糖( GalNAc)可以使PEC化的紫杉醇前药水溶性明显提高,且化,与唾液酸相连的PEG通过唾液酸转移酶与对乳腺癌MCF-7细胞和非小细胞肺癌细胞的抑制GalINAc残基相连,从而将PEG定点修饰到蛋作用与紫杉醇相当。PEG化的喜树碱也采取了类白上。似的前体药物的形式，以不同酯类和甘氨酸作为连/接链,PEG化的喜树碱溶解度增加了近千倍,且由于EPR效应,其肿瘤组织中的浓度与正常组织中) CaNAc.2 .ST6GalNAc-IST'DP-ST-一 。 ST圆◆PEG的浓度之比较喜树碱高30倍”。CMP◆PEGEnzon公司开发了两个复杂的前体药物系S/T$T统一苄基消除 系统和三甲基内酯化系统,在正常H2,NH2生理环境下,这两种系统先经过酶解,再分别通过1,6消除反应和内酯化反应释放出药物8。通过Figure 3 IFN~a2b containing natural nouilied 0 gyoylation site(orange) in which s setine (S) or threonine (T) reidue may sere龋调整连接臂的种类、数量,能够获得不同的释药速n cceptoer for selective adition of GalNAc by a polypepide度,实验证明用苄基消除系统和三甲基内酯化系统GalINAc transferase修饰柔红霉素,抑瘤活性比原型药物均提高10倍如图3所示,重组的IFN-a2b中含有一个天然以上。的未修饰0-糖基化位点,其中的丝氨酸或苏氨酸rPEG与药物连接的断裂,主要有4种方式:①残基可以作为乙酰半乳糖胺转移酶(如GalINAc-水解前药在 正常体内环境(pH 7.4)下水解;T2)的识别位点并将其乙酰半乳糖化。与PEG偶②pH依赖性断裂一前药在特定 pH值范围内释联的唾液酸通过唾液酸转移酶(ST6GalNAc-I)就放,如mPEG硫代丙酰胺与阿霉素的马来酰亚胺可以与乙酰半乳糖胺残基相连实现定点PEG化。的衍生物反应生成腙,并在肿瘤细胞核内和溶酶体利用这种技术开发的PEG化促红细胞生成素处已内的酸性环境下,发生水解并释放出阿霉素;③酶于II期临床研究阶段。解一-很多抗肿瘤药物 ,利用肿瘤组织中含量较高的酶催化PEG与药物的连接断裂,达到肿瘤靶向2 PEG 化疏水性药物给药;中国煤化工的还原性物质,虽然PEG初期主要用于修饰蛋白质药物,但如极;YCNMHGPEG与药物的近来研究人员发现:许多疏水性药物,由于极难溶连接。382中圃巢科大学学报Joumal of China Pharmaceutical University第39卷聚合链如:聚氨基酸、聚甲基丙烯酸等。载体材料3 PEC 化纳米共聚物给药系统通过静电吸附、氢键等弱作用力与药物结合,在水粒径小于1 um的纳米微球由于能够穿过上皮溶液中形成纳米尺寸的胶束。值得注意的是,只有组织,通过毛细血管更有效地被吸收,近年来受到人当两种相反离子的数目相匹配时,才能形成较为稳们的普遍关注。但纳米微球在体内会被网状内皮系定的胶束。这种给药系统的优点在于没有使用有统(RES)摄取而清除，因此如何减少RES摄人是研机溶剂和表面活性剂，能最大限度的保持蛋白质类究者关注的问题。最近研究趋势之-是对纳米载体药物的活性,因而受到了广泛的关注。进行聚乙二醇化。近年来,有大量关于将PEG作为由于胶束内核是由静电吸附而形成的,这种离亲水基团引人纳米粒载体的研究报道。子型胶束系统对电解质的浓度非常敏感,因此可通3.1PEG化的两亲型共聚物纳米给药系统过调节体系的离子强度来控制药物的释放行为。两亲型共聚物纳米体系是目前研究最多的聚Xiong等[")设计了一种pH敏感的PEG化的二元合物纳米给药系统。通常两亲型共聚物包括亲水阳离子纳米系统,这种PEG修饰的聚天冬氨酸和性的PEG和亲脂性的聚酯链段,在水中形成胶束.聚赖氨酸的嵌段共聚物,其释药过程主要依靠电荷后,其亲脂部分团聚在- -起,形成类似于固体的核间的相互作用而表现出一定的pH依赖性,因而用心，而PEG链段则在外围呈溶于水的液状。作抗肿瘤的基因转运载体时,对正常细胞的毒性几常见的PEG化的两亲性共聚物包括:聚乳酸-乎可以忽略不计。聚乙二醇(PLA-PEG)、聚乙交酯丙交酯聚乙二醇阳离子聚合物DNA的复合物称为Polyplex,(PLCA-PEG)、聚己内酯-聚乙二醇( PCL-PEG)、聚戊包括聚醚酰亚胺(PEI)、聚丙烯亚胺树状物、聚赖内酯~聚乙二醇( PVL-PEG)等。这些两亲性共聚物氨酸、聚精氨酸等;PEI因具有“质子海绵效应”而形成的纳米胶束可包裹各种生物活性药物，尤其是应用最为广泛。但是PEIDNA复合物若不经任何胶束的疏水核可有效包裹- - 些疏水性药物,大大拓修饰而直接应用体内时会面临许多障碍,如:易与.展了其应用。Lin 等[9]分别用PLA-PEG、PCL-PEG、血浆蛋白相互作用,易激活补体系统等,PEG修饰PVL-PEG制备了粒径在150 ~200 nm的胶束,体内则有助于解决这些障碍。Vroman 等[2)研究发现，实验结果显示PEC化的几种纳米胶束可以减少药未经PEG修饰的polyplexes静脉注射后迅速和血物在肝肾的代谢,具有较长的血浆半衰期。浆蛋白结合;而经PEC修饰则能有效降低这些作近来还有一些值得关注的研究发现,一些用,并降低红细胞的聚集,延长循环时间，PEG修PEG化的纳米胶束可以通过血脑屏障,分布于脑饰还能避免自身聚集,有效降低颗粒大小,有效拮组织,这给一些脑部疾病的治疗带来了新的希望。抗血清对基因转染的抑制。如Lu等[10]报道将阳离子卵清蛋白结合到PEG末也有研究报道, PEG修饰后的PEI的转染效率端,制备成纳米颗粒包裹肿瘤细胞凋亡因子有所降低,为了克服这一局限性,目前广泛采用在(TRAIL)的质粒,给荷瘤小鼠静脉注射24 h后可转染复合物表面偶联相应配体来增加转染复合物以在脑内及肿瘤细胞中检出TRAIL的mRNA和蛋和细胞间作用，以启动受体介导的细胞内吞白的表达。重复多次注射后,可诱导肿瘤细胞的凋行为[时。亡并延缓肿瘤的生长。3.3 PEG 化对纳米共聚物药动学性质的影响尽管两亲型共聚物纳米给药系统具有血液中与一般纳米载药微粒相比,经PEC修饰的共循环时间长、微粒尺寸小、稳定性强等优点,但由于聚物纳米微粒,由于PEG在其表面形成-个保护在包裹过程中使用了有机溶剂和强力搅拌,蛋白质层,可能在以下方面对药动学性质产生影响。药物存在失活的现象,并且胶体体系的载药量较3.3.1增加药物在体内滞留时间,延长其 血浆半低,还有待于进-步的改进。衰期_PEG保护层可降低单核吞噬系统对纳米微3.2 PEG 化的离子型聚合物纳米给药系统粒的中国煤化工帶留时间。离子型纳米给药系统所采用的载体材料是完3.3.2!YHCNMH G靶向性Kim全水溶性的,包括PEG链和带阴离子或阳离子的等[4.5↓5在对聚乙二醇-聚十六烷基氰基丙烯酸酯第4期田法等:聚乙二醇化技术在药物转运 系统中的研究进展383(PEC-PHDCA)纳米微粒的研究中发现，这种纳米且药效维持时间较长,可能是由于PEG的引入使共聚物可以通过血脑屏障分布于脑组织,其作用机得RES系统对药物的吞噬作用减弱,脂质体在血制可能是PEG-PHDCA纳米微粒和载脂蛋白E结液中循环时间延长所致。合后由载脂蛋白E受体介导的胞吞作用而引起4.2 PEG 化的免疫脂质体的。还有文献报道, PEG-PHDCA纳米粒在肝中的免疫脂质体是在脂质体的基础上,在修饰物或累积比PHDCA纳米粒少很多,在肺和骨髓中PEG-脂质体表面连接单克隆抗体,賦与其主动靶向性,PHDCA共聚物的分布也很少,而在脾中的分布却从而提高疗效。在第二代、第三代的免疫脂质体比PHDCA纳米微粒多。这种PEG-PHDCA共聚物中,人们通过PEG将抗体或具有靶向作用的分子在脾中的高累积量有利于脾靶向的活性物质的连接到脂质体上,这样既能增加脂质体的靶向性,输送。又可以通过PEG遮蔽单核巨噬细胞系统的调理作3.3.3提高主动靶向性PEG 化技术还可以使用,从而更好地发挥药效。Yang 等[8]在最近的研药物只作用于病变部位的靶组织，提高药物的生物究中报道,通过PEG将Hercepin( 商品名:Trastu-利用度,达到主动靶向释放。如将高特异性的配体zumab)偶联到脂质体表面,通过Herceptin对(如:抗体多糖等)通过PEC的活性端基连接到纳HER2受体的高亲和力而形成靶向性，HER2受体米载体的表面而产生高度靶向性。Garinot 等[6)研过表达的肿瘤细胞对Hereptin修饰PEG化的脂究发现,在PEC化的PLGA纳米颗粒末端连接质体的摄取明显增加。在对所包载药物紫杉醇的RGD序列肽(精氨酰甘氨酰-天冬氨酸),可以形药动学性质研究中发现，PEG化的免疫脂质体包成对M细胞的靶向性,从而提高口服疫苗的转运载的紫杉醇的半衰期明显长于普通脂质体而略低效率。于PEG化的普通脂质体。综上所述,亲水性PEG修饰的纳米粒的血浆4.3 PEG 化的转基因脂质体清除率和RES摄取显著减小，并且PEG引人会影脂质体DNA复合物称为Lipoplex,转基因脂质响纳米粒的生物降解行为,调节释药方式。从药物体可以分为阳性、中性、阴性脂质体等,其中以阳性活性角度出发分析,这种由PEG形成微环境,也将脂质体应用较多。脂质体静脉注射后会直接和白有利于多肽和蛋白质药物在储存和给药过程中保蛋白、酶、红细胞等反应引起脂质体破裂,包含物外持其活性。泄,很快被网状内皮系统细胞识别并摄取降解,并引起红细胞聚集,所以应用受到限制,进行PEG化4 PEG 化脂质体以后,可以降低红细胞聚集。有研究人员采用X4.1 PEG化的隐形脂质体衍射技术研究PEG修饰后脂质体,结果显示PEG20世纪80年代末,脂质体作为药物载体的研化的脂质体仍为层状结构,相对分子质量2000以究取得了重大突破。在对传统的脂质体进行改进上的PEG才能屏蔽脂质体表面阳性电荷,而长链中,采用PEG修饰取得了很好的效果。近年来人PEG的导人使得脂质体结构更为稳定。文献报们研究出了含有PEG的隐形脂质体和免疫脂质道，在阳性脂质体中引人PEG后,和未经过修饰的体。隐形脂质体的组分中含有PEG的二硬脂酸磷脂质体相比,体外转染效率不变,质粒DNA循环时脂酰胺( DSPE)衍生物( PEG-DSPE)。没有PEG的间明显延长。这些结果表明PEG修饰后的脂质体脂质体,血浆蛋白很快黏附于脂质体表面,激发单结构更加稳定,能有效抵抗血清蛋白以及冻存等过核巨噬细胞系统对脂质体进行清除,使得脂质体在程的影响19.20。血液中停留时间短,药物的靶向释放减少。如5结语PEG-DSPE修饰的紫杉醇脂质体,血浆半衰期从普通脂质体的5.05 h延长到15.8 h,在脾、肝等脏器PEG修饰药物技术已经诞生30多年, PEG修的摄取不足10%”]。而传统的紫杉醇脂质体被饰的中国煤化工分子药物、聚合单核巨噬细胞系统吞噬50%以上。一般研究认物、脂| YHC N M H G质量也从几千扩为,PEG化的脂质体其突释现象较普通脂质体小展到几万乃至 更高;与药物的连接方式也不再局限384中国巢科大学学报Joumal of China Pharmaceutical University第39卷于永久性连接,而出现了可释放性连接;PEG的活[10] Lu w. Sun Q, Wan J,et al. Cationie albunin conjugted peg-化方法也日益多样;PEG结构也从直链扩展到支ylated nanoparticle alow gene delivery into brain tumors via intravenous administration[J]. Cancer Res ,2006 ,66(24):11 878链、树形等;修饰方式也逐渐从随机修饰逐渐向定-11887.向、定量修饰方向发展。[11] Xiong MP, Bee Y, Fukushima s, e al. pH-Reponsive multi-8个PEG化药物在美国的上市充分证明了PEGylated dual cationic nanoparticles enable charge modulationsPEG修饰技术的重要性和实用性。随着PEG修饰for Sate gene deivery[J]. ChemMedChem ,2007 ,2(9);1 321 -技术的不断发展,还会有更多的PEG修饰药物进[12] Voman B, Ferein I, Jerome C,et al. PEGylated quatemized人市场。copolymer/ DNA complexes for gene delivery[J]. Int J Pharm,参考文献2007 ,344(1-2):88 -95.[13] Kim WJ,ockman JW ,Lee M,en al. Soluble FI-I gene delivery[1]、Veronese FM, Pasut C, PEGylation, sccessful approach to drugusing PEI-g-PEC-RCD conjugate for anti-angjogenesis[J]. Jdelivery[J]. Dnug Disco Today ,2005 ,10(21):1 451 -1 458.Control Releaxe ,2005 ,106(1-2) :224 -234.[2] Hao Y,Chen J, Wang X,e al. 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