乙醇消耗菌的分离鉴定及其对基因工程集胞藻乙醇产量的影响

第38卷第3期水生生物学报Vol. 38. No. 32014年5月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAMay,2014doi:10.7541/2014.69乙醇消耗菌的分离鉴定及其对基因工程集胞藻乙醇产量的影响葛平平2陈林张维!董庆喆刘天中吕雪峰(1.中国科学院青岛生物能源与过程研究所,生物燃料重点实验室,青岛266101;2.中国科学院大学,北京100049)摘要:为研究产乙醇基因工程集胞藻培养液中的乙醇消耗菌污染情况及其对乙醇产量的影响,从污染的培养液中分离岀4株乙醇消耗菌,通过16SτDNA、26SτNA序列分析对分离岀的菌株进行鉴定,并研究其乙醇消耗能力及对基因工程集胞藻乙醇产量的影响。结果表明,分离岀的4株菌分别为红酵母( Rhodotorulasp)、季也蒙酵母( Meyerozγ na guilliermondii)、短波单胞菌( Brevundimonas sp.)、微杆菌( Microbacterium sp.)其中乙醇消耗能力最强的是红酵母,乙醇比消耗速率达到391g(103scfu-d;其次为季也蒙酵母,乙醇比消耗速率为80.1g(103cfud);短波单胞菌和微杆菌的乙醇比消耗速率远低于红酵母和季也蒙酵母。将分离出的菌株与产乙醇集胞藻共培养d后,污染红酵母、季也蒙酵母、短波单胞菌、微杄菌的实验组乙醇产量分别下降了53.8%、23.6%、40.7%、27.3%。4株菌对基因工程集胞藻的生长无明显影响,均通过直接消耗乙醇而降低集胞藻的乙醇产量关键词:乙醇消耗菌;微生物污染;生物乙醇;基因工程集胞藻中图分类号:Q94922文献标识码:A文章编号:1000-3207(2014)03-0487-08生物乙醇是重要的生物液体燃料之一,可作为巴氏醋杆菌、门多萨假单胞菌等都可代谢乙醇611汽油替代品或可再生交通燃料添加剂。应用基因其中巴氏醋杄菌的乙醇消耗速率达到2.3mLd。而工程蓝藻直接利用太阳能和CO2一步法生物合成乙在管囊酵母2、酿酒酵母中,乙醇的合成代谢和醇具有独特的优势,因此成为各界关注的热点2S。分解代谢同时存在。如果污染了这些微生物,也可目前,用于生产乙醇的基因工程蓝藻主要有聚球藻能严重影响乙醇产量。目前,关于微生物污染对基( Synechococcus sp.PC7942)和集胞藻(Swne-因工程集胞藻乙醇产量的影响还未有报道。chocystis sp.PCC6803)3S等,最高乙醇产量达到本研究从污染的产乙醇基因工程集胞藻的培养5.5g冮,显示出太阳能生物转化直接合成乙醇的液中分离岀4株乙醇消耗菌,评价各菌的乙醇消耗巨大澘力。然而,有研究表明基因工程集胞藻的乙能力以及对基因工程集胞藻的生长和乙醇产量的影醇产量很不稳定,在培养后期培养液中的乙醇浓度响,并采用形态观察和基因序列分析手段鉴定污染急剧下降5,因此研究确定影响乙醇产量稳定性菌的种类,以期能为蓝藻乙醇的培养工艺及污染控的因素对生产工艺的建立有重要意义制提供理论参考。在我们的前期工作中发现,基因工程集胞藻在培养过程中易发生食藻生物和微生物污染,尤其是材料与方法在放大培养阶段这种污染尤为严重。食藻生物会昋1.1藻种及培养方法食藻细胞,使生物量迅速下降,从而降低乙醇产量。产乙醇基因工程集胞藻 Synechocystis sp.PCC自然界中存在着多种能利用乙醇的微生物,例如醋6803 Syn-ZG25,由中国科学院青岛生物能源与过酸菌、面包酵母、嗜有机甲基杆菌、枯草芽孢杆菌、程研究所构建。集胞藻在250nL三角摇瓶(装液稿日期:2013-04-10;修订日期:2013-1225基金项目:国家高技术发展计划(863)(2012AA052103)资助作者简介:葛平平(1988—),女,河北保定人;硕士研究生;主要从事生物化工研究。E-mail: gepp(@qibebt通信作者:陈林,Tel:0532-80662737;E-mal:chenlin(@qibebtac.cn488水生生物学报38卷量100mL)或直径30mm的气泡柱式光反应器(装液提取的基因组DNA为模板,用高保真aq酶进行量200mL)中培养,通入含5%CO2的空气混合气,PCR扩增。反应条件为:95℃5min;94℃30s,55℃通气速率(10±2)Lh,光强100μmol(m2s,培养温lmin,72℃lmin,34个循环;72℃10min。PCR产物度(30±2)℃。培养基为BGI!培养基,其中含用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检验。目的基因片段克20mgL壮观霉素( Spectinomycin, Sigma)14隆:将PCR产物用DNA纯化试剂盒( Cycle-Pure Ki1.2乙醇消耗菌的分离纯化美国 Omega公司进行纯化,产物与pMDl8-TV培养基(1)初筛培养基:牛肉膏3gL,蛋白胨tor连接后转化到E. coli dh5α感受态细胞中,涂布10g,NaCl5gL,乙醇2g/L,壮观霉素20mg,到Amp抗性平板上培养9-16h挑取3个单克隆琼脂15g/;(2)复筛培养基: BGll培养基中添加扩繁后送上海桑尼生物科技有限公司测序,将测2g/L的乙醇,20mgL的壮观霉素,15gL的琼脂;序结果与 Gen Bank中已有序列进行比对和同源性(3)纯化培养基:牛肉膏3g/L,蛋白胨10g/,NaCl分析5g冮L,乙醇2g,琼脂15g/L;(4)发酵培养基:牛1.4乙醇消耗菌的生长及乙醇消耗速率测定肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5gL,乙醇23g/L,乙醇消耗菌生长曲线的测定挑取纯化后的单壮观霉素20mgL菌涪接种于发酵培养基中培养24h,取适量培养液乙醇消耗菌的分离及纯化(1)初筛:集胞藻在在60m下测定其吸光度(A6),然后稀释至A6o0°气泡柱式反应器中通气培养12—14d后,经无菌检0.05,按10%接种量接种至发酵培养基中,于30℃、测为阳性,作为染菌藻液。取染菌的Syn-zG25藻液,180r/min摇床中培养,定时取样测定菌液A6。每经梯度稀释后涂布于初筛培养基平板上,置于30℃实验组设2个平行,对照组中接种等体积的无菌培生化培养箱中培养。待平板上有单菌落长岀后,依养液。据菌落形态和显微观察结果,分别挑取多株菌落菌液细胞浓度的确定取生长至对数期的菌液形态和显微形态相同的单菌落培养。(2)复筛:将初测定其A6。梯度稀释后采用平板活菌计数法测定筛得到的各菌株分别在复筛培养基平板上划线或细胞浓度,计数时仅选取菌落数在20--200的平板,涂布,平板放置于30℃生化培养箱培养7—10d,每株菌每浓度做3个平行。用 Origin拟合出菌液A60长出的菌株在纯化培养基平板上经多次传代后作与细胞浓度D( Cell density, cfu/mL)的关系,结果列为复筛菌株入表11.3乙醇消耗菌的鉴定菌落及个体形态观察在纯化培养基平板上,表1各菌菌液A6与其细胞浓度D的关系Tab, I Relationship between A660 and cell density利用目测法观察乙醇消耗菌的菌落形态。挑取纯化菌株编号关系式拟合系数后的单菌落接种于发酵培养基中,培养24h后取适 Strain numberEquationGRI30.994量菌液低速离心,收集菌体,依次使用2.5%戊二醛D=1.179×107·A6a+68.12GTID=2.327×100·A60+62.750.990溶液和1%锇酸固定,经乙醇梯度脱水后喷金处理,D=5.641×10·A6+16.67然后用冷场发射扫描电子显微镜(S-4800型,日本GY22D=2.036×10°A60+97540.994Hitachi公司)进行个体形态观察。乙醇消耗菌的16 RdNA及26 S rDNA序列测定乙醇消耗速率的测定将培养1824h后的各根据各菌的菌落和个体形态分析,4种菌可能分属细菌接种到装有20mL发酵培养基的锥形瓶中,根据菌和酵母两大类,因此同时进行了16SrNA及26S拟合得到的公式将培养液适当稀释,使其初始细胞rDNA序列测定。引物设计:分别选用16 S TDNA通浓度维持在10 cfu/mL,将锥形瓶置于30℃、180rmin用引物对27F(5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3)摇床培养。以不接菌实验组为对照,每组实验设21492R(5 TACCTTGTTACGACTT-3)以及26 S TDNA个平行。每6h取样测定细胞浓度,并用生物传感分通用引物对NL1(5' GCATATCAATAAGCGGAGGA析仪(SBA-40D,山东省科学院生物研究所)测定培AAAG-3^)NL4(5′ GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)。养液中乙醇浓度4PCR反应体系与条件:PCR反应采用50μL体系,以乙醇的比消耗速率按公式(1)计箅葛平平等:乙醇消耗菌的分离鉴定及其对基因工程集胞藻乙醇产量的影响和采用平板活菌计数法测定菌的细胞密度=×10(1)(t2-1)·D16基因工程集胞藻生长的测定其中,Q为比消耗速率,单位为g(cfud),C表示4考虑到乙醇消耗菌在730nm处也有光吸收,因此以叶绿素a的含量计量集胞藻的生物量。取1mL时刻的乙醇浓度,单位为gL;D为到t2时间段内的平均细胞浓度,按照公式(2)计算:藻液,离心收集藻细胞,再加入ImL甲醇重悬浸泡60℃水浴避光提取30min,离心取上清液测定665nmD=2+D,(2)下的吸光度,计算叶绿素a含量1.7统计分析1.5乙醇消耗菌对基因工程集胞藻乙醇产量的影响统计分析采用单因素方差分析( One-Way ANOVA无菌藻种在三角瓶中培养至对数生长期后,接方法,使用SPSs10软件。种于气泡柱式光生物反应器(装液量200m)中,每24取样,测定藻液的叶绿素a含量及乙醇浓度。自2结果培养第4天始,向各实验组中分别接种稀释至一定21乙醇消耗菌的分离及鉴定细胞浓度的菌液2mL,使各乙醇消耗菌细胞终浓度从污染的基因工程集胞藻培养液中,经过初筛、为0° cfu/mL,对照组加入2mL无菌水;每组实验多次纯化及复筛、得到4株具有乙醇消耗能力的菌,设2个平行。每24h取样,测定藻液的叶绿素a含分别编号为GRl3、GWl3、GT17、GY22四株菌分量及乙醇浓度。对照组及实验组毎48h作无菌检测别在30℃恒温箱中培养5d后的菌落特征列入表2。表2四株乙醇消耗菌的菌落特征Tab 2 Colony characteristics of the four ethanol consuming microorganisms菌株编号菌落直径菌落颜色菌落形状边缘表面正反面颜色差别Strain numDiameter of colony(mm) Colony color Colony shapeface Color difference of both sideGRI红色圆形,帽子状整齐无GW13纯白色圆形整齐无乳白色圆形整齐光滑无GY223-4橘黄色圆形,帽子状整齐无扫描电镜观察显示(图1),GR13菌的细胞为球形或椭球形细胞直径约24m;GW13菌的细胞呈卵球形,长度约1.53μum,GT17菌的细胞呈杆状,直径约为0.3gm,长度约1-2umGY22菌的细胞呈短杆状,直径【R1约0.30.4μm,长度约0.81.2μm。综合考虑四株菌的菌落和个体形态,初步认为GRl3和GW13属于酵母菌,GT17和GY22属于细菌。随后分别提取各菌的DNA,并进行16 S rDNA及26SrDNA序列测定,将测得的序列在 Genbank blast进行同源性图1四株乙醇消耗菌的个体形态比对(表3)ig. I The morphology of the four ethane490水生生物学报38卷表3四株乙醇消耗菌的同源性比对结果Tab 3 BLAST results of the four ethanol consuming microorganisms菌株编号序列长度生物名同源性覆盖率StMicroorganismIdentity(%) Cover(%)Rhodotorula mucilaginosaGRI3Rhodotorula sp. M26Rhodotorula sp. MARY 160Meyerozyma guilliermondii strain KAML05GW13570Meyerozyma guilliermondii strain KAMLo3Brevundimonas diminuta atcc 11568GTI1385Brevundimonas terrae strain KSL-145Mycoplana bullata strain IAM 1315397.9100Microbacterium hominis strain DSM 12509l00GY221444Microbacterium trichothecenolvticum strain DSM 860Microbacterium testaceum strain DSM 2016698.1l00从比对结果可以看出,菌株GRI3、GT174株菌的初始接种浓度均为10°cfu/mL,在此GW13、GY22分别与黏质红酵母( Rhodotorula muci--条件下,发酵培养基中乙醇浓度变化见图3。其中laginosa)、缺陷短波单胞菌( Brevundimonas diminuta对照组由于自然挥发的原因,乙醇浓度略有下降ATcC1568)季也蒙酵母( Meyer- ma guilliermondii在扣除因自然挥发而消耗的乙醇后,除了GY22外,strain Kaml05)人型微杆菌( Microbacterium homini其他三个实验组中的乙醇浓度均显著下降(P