半纤维素发酵生产燃料乙醇的研究进展

酒科技2004年第5期(总第125期)Liquor-making Science TechnologyNo.52004Tol125半纤维素发酵生产燃料乙醇的研究进展张宇昊,王颉,张伟,李长文,马良,周威(河北农业大学食品科技学院河北保定071001)摘要:将半纤維素转化成燃料酒精时,必须先转化成小分子的半纤维素糖,之后发酵成酒精。预处理是关健工艺酶解前用CO3爆破法对纤维物质进行预处理效果很好;酶解前用稀酸预处理可将半纤维素和淀粉转化为单糖,而剩余的纤维素成分可用纤维素酶将其水解为小分子糖,该法是一种很好的将玉米纤维转化为可发酵糖的工艺。应用代谢工程作为工具选育一些蔺株,可有效而经济地将半纤维素水解液中的各类糖类转变为有用的产物。(陶然)关键词:燃料乙醇;半纤维素;预处理;半纤维素水解糖中图分类号:Ts2622;TS2614文献标识码:B文章编号:0019286(20405-002203Research Progress of Hemicellulose Fermentation to Produce Fuel AlcoholZHANG Yu-hao, WANG Jie and ZHANG Wei et al.(Food Science Technology College of Hebei Agriculture University, Baoding, Hebei 071001, China)Abstract: Before the conversion of hemicellulose into fuel alcohol, hemicellulose must firstly be converted into micromolecule hemicellu-lose sugar and then into alcohol through fermentation. During the conversion, pretreatment was a key technique. CO, blasting methodapplied in pretreatment before enzymolysis could achieve satisfactory effects. Diluted acid pretreatment before enzymolysis could converthemicellulose and amylum into monose, and the residual cellulose components could be hydrolyzed into micromolecule sugar by cellelase. It proved a good technique for the conversion of corn cellulose into fermentable sugar. And some strains developed by the meanof metaboly work could effectively and economically convert varieties of sugar in hemicellulose digest into useful product. (Tran. byYUE Yang)Key words: fuel alcohol; hemicellulose; pretreatment; hemicellulose hydrolyzed sugar在自然界中普遍存在的木质纤维素( lignocellulosic materi-醛酸叩。米糠中性木聚糖包括46%的木糖,4.9%的阿拉伯糖6.als),主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,这些物质是陆生植%的半乳糖,19%的葡萄糖和11%的脱水糖醛酸。小麦阿拉伯木物细胞璧的主要组分。半纤维素较集中于初级和次级细胞壁中,与聚糖包括658%的木糖,335%的阿拉伯糖,0.1%的甘露糖0.1木质素和纤维素结合在一起,以增强细胞壁的强度"。%的半乳糖和03%的葡萄糖。玉米纤维木聚糖是一种包含B-1近年来,半纤维素由于其在工农业的实际应用而受到重视,其4键合木糖残基的复杂异质木聚糖,包括48%-54%的木糖,33%中半纤维素物质因其可高效地转化成燃料酒精而备受关注。在半35%的阿拉伯糖,5%-11%的半乳糖和3%-6%的葡萄糖醛酸纤维素转化成燃料酒精时,其必须先转化成小分子的半纤维素糖,四。之后再发酵成酒精。本文对半纤维素的结构及其糖化发酵的方法2半纤维素的预处理做一介绍。纤维物质包括不同的农业废弃物(秸秆壳、茎、杆)、落叶和松1半纤维素的结构木、城市废物及工厂的纸浆废物、草本农作物。这些物质的组成不半纤维素是戊糖(木糖、阿拉伯糖)、己糖(甘露糖、葡萄糖、半同,主要组分是纤维素(20%-35%),其次是半纤维素(20%-35乳糖)和糖酸所组成的不均一聚糖,为异质多糖,结构与纤维素不%)和木质素(10%-25%)。蛋白质、油脂和灰分是土壤纤维物质同硬木半纤维素中含有较多的木聚糖,但软木半纤维素中则含有的其他组成成分叫。表1列出了部分纤维物质的主要组成。这些物较多的葡甘露聚糖凹。质的结构非常复杂,而且本身的组成对酶解具有一定的抗性。在一木聚糖是含量最多的一类半纤维素叫。木聚糖被分为线性同般纤维物质的结构模式中,纤维素纤维被镶嵌在一个木质多糖的型木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡萄糖醛木聚糖和葡萄糖醛阿拉伯矩阵中。木聚糖在以共价键和非共价键联结的完整细胞壁中起着糖基木聚糖十分重要的作用大约80%的木聚糖主链含有侧链,阿拉伯糖和葡萄糖醛酸的纤维素物质的预处理是酶解的关键。预处理主要包括粉碎、溶单体侧链及包含阿拉伯糖、木糖及半乳糖残基的寡聚侧链分别键解、水解和分离纤维素、半纤维素和木质素组分。这些方法包括浓合于主链D-木糖残基的C-3和C-2位置上。不同源的木聚糖,酸、稀dYH中国煤化工爆破、潮湿-氧化、石灰处如草、谷类、软木和硬木其组成上都有所不同。桦树木木聚糖包括理、热在每种处理中,原物质893%的木糖,1%的阿拉伯糖,14%的葡萄糖和83%的脱水糖的体CNMHG稀酸预处理有两种方法收稿日期:2003-12-22;修回日期:2004-05-28作者简介:张宇吴(1978-),男,在读硕士研究生004年第5期(总第125期)酿酒技No.52004To.125r-making Science Technology部分纤维素物质的组成3半纤维索的酶解多糖组分(%)木聚糖的全部生物降解需要内切型β-1,4-木聚糖酶和外切纤维素半纤维素米纤维型β-木糖苷酶及几种辅酶,例如:a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶,a-葡米穗轴玉米秸秆550500535萄糖苷酶醋酸木聚糖酯酶和P-香豆酸酯酶。这些酶对于各种木572052聚糖的水解都是必要的。内切型β-1,4-木聚糖酶从β-1,4-木聚25糖主链的内部切割木糖苷键,使木聚糖降解为木寡糖,外切型β-木糖苷酶通过切割木寡糖的末端而释放木糖残基。α-L阿拉伯柳枝稷呋喃糖苷酶和α-葡萄糖苷酶可从木聚糖主链上移除阿拉伯糖和百慕大海岸草4-0-甲基葡萄糖酸。酯酶可水解连在木聚糖木糖单元和醋酸(醋对于较少的固体量(5%-10%,w/w)采取高温(>160℃)连续流程酸木聚糖酯酶)之间或阿拉伯糖侧链残基和酚酸之间的酯。法,对于较多的固体量(10%40%)采取低温烘烤过程阿。高温下许多微生物有可以完全降解木聚糖的酶系,例如:青霉菌的稀酸处理通常把半纤维素处理成可用性糖(木糖、阿拉伯糖和其( Penicillium capsulatum)和( Talaromyces emersonii)a。 Bachmann他糖)。剩余物包括纤维素和其他木质素。木质素可以被一些溶剂和 McCarthy报道了嗜热放线菌类( Thermomonospora fusca)中的(如乙醇,丁醇,乙酸)浸提。含木质素的纤维素可水解成水溶性糖内切型β-1,4-木聚糖酶、外切型β-木糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃和不可溶的残渣,即木质素和一些未反应物。在蒸汽处理中,SO2糖苷酶和醋酸木聚糖酯酶间有很显著的协同作用。而以醋酸木聚可作为一种催化剂使纤维素酶解得更加彻底,并提高半纤维素水糖作为底物的酶解证明了主链的解聚与侧链的裂解之间的协同作解糖的回收总量。对于柳木的蒸汽处理,温度在200-210℃并添用。许多木糖酶无法分解侧链处的木糖单元。要想使木聚糖主链加1%w/w)的SO2是最佳条件。以柳木中的可利用多聚糖计算,葡被完全水解就必须使其侧链也被裂解。另一方面,几种辅酶也只能萄糖产量可达理论值的95%。利用蒸汽降解半纤维素的方法通常裂解木聚多糖的侧链,只有木聚糖被部分水解这些酶才能去裂解包括高温短时(270℃,1min)和低温长时(190℃,10min)y。Mor-其侧链。总之,虽然木聚糖结构比纤维素复杂,且需几种具有不ano和Cray报道说,100g甘蔗渣在加入1%硫酸且水体=21同特异性的酶才能完全水解,但木聚糖的多糖不形成类似纤维素的情况下在220℃进行蒸汽爆破,之后进行酶解,可产生651g蔗的晶状结构,因此相对来说木聚糖更容易被酶水解玉米纤维是玉米湿磨后的一种副产物,包括20%淀粉,15%酶解前用CO2爆破的方法对纤维物质进行预处理效果很好。纤维素和35%的半纤维素吗。Saha和 Boyhast评估了为使玉米纤eng比较了用CO2蒸汽爆破和氨爆破对甘蔗渣预处理的效果,维素中的淀粉、纤维素、半纤维素转化为可发酵糖的几种预处理方发现CO预处理的效果要好于氨处理的效果,且CO2爆破的过程法及其转化的程序预处理方法包括热水处理、碱处理、稀酸处理中不会产生阻碍水解的物质。CaoP报道了一种预处理的方法,为热水预处理(12l℃,1h)有利于淀粉和纤维素的酶解,但不利于半了分离出木质素、醋酸盐和一些浸提物,将纤维物质(以玉米穗轴纤维素的酶解。用碱进行预处理(10:1,w/w,121℃,3h)半纤维素作为给料)在环境温度下浸泡在稀的NHOH中一段时间,之后用酶也无法完全水解玉米纤维中的半纤维素。用稀酸预处理可将半稀酸处理即可轻易地将半纤维素水解为小分子糖,纤维素的残渣纤维素和淀粉转化为单糖,而剩余的纤维素成分可用纤维素酶将则可被酶解为葡萄糖。 Kurakake用氨水预处理甘蔗渣秸秆和柳其水解为小分子糖。此过程为玉米纤维(15%固体,w/v)加入稀酸枝稷以提高其酶解效果。湿氧法可使纤维物质转变为部分可溶的(0·5%HSO,vv)于121℃lh,中和至pH5.0之后将预处理过的半纤维素水解糖和部分不溶的纤维素,而纤维素部分则可被轻易玉米纤维用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶处理。此处理后的单节显性地转化为酶解多糖。 Bjerre发现碱和湿氧法联合不会产生糠醛糖的产量可达理论值的85%-100%,且这一过程不产生类似于糠5-羟甲基糠醛等阻碍水解的物质。 Klingel概括了碱性湿氧法处理醛等的发酵抑制物。因此,是一种很好的将玉米纤维转化为可发酵麦秸的降解产物,从CO2和水、羧酸中分离出的是半纤维素和木糖的工艺。质素的降解产物。控制温度及碱的添加量可把芳香醛的形成率降Leathers和Gupa描述了用一种从 Aureobasidium sp中制成到最低。表2列举了纤维素物质的处理方法。的粗酶制剂使玉米纤维水解的过程,结果显示这种粗酶制剂只能土壤纤维素物质的处理方法部分水解其中的木聚糖。Saha从132个腐木和腐烂秸秆旁的土样中分离出了3株真菌,都有将玉米纤维中的木聚糖当作底物生长热-机械法热磨、热剪、热压的能力,即从此3株菌中制得的粗酶制剂可很好地降解玉米纤维自动水解法蒸汽加压、蒸汽爆破、二氧化碳爆破酸处理稀酸处理、浓酸处理中的木聚糖。但从两株菌中分出的内切-木聚糖酶却无法降解玉氨法、碱湿氧法米纤维木聚糖,而分离出的纯的β-木糖苷酶则可从短链木聚多糖有机溶剂处理甲醇处理、乙醇处理、丁醇处理中释放木糖残基。由此可见,为了高效地水解木聚糖底物,将内些来自木质素降解的芳香化合物,来自糖降解的呋嘯衍生切-木聚糖酶与几种辅酶联合使用是必要的。另外B-木糖苷酶则物和一些脂肪酸被认为是处理纤维物质过程中产生的阻碍物叫,可被一些木糖抑制,因此为了使以木聚糖转化为酶解多糖可以商为了将这一影响降至最小,人们做了很多研究其中包括离子交换业化,提高R有的木糖酎受件也是必要的。树脂法、用木霉属( trichoderma)的丝状真菌预处理、不挥发复合物4由半中国煤化工的去除、醚或烷基醋酸盐的浸提碱或醋酸钠的处理。 Persson在CNMH和效率,半纤维素糖的用面包酵母发酵经稀酸处理过的云杉前,用逆流超临界萃取的办利用十分重要在2002年,酒精产量超过2亿加仑,主要是以玉米法为之“解毒”。淀粉为原料生产的。燃料酒精一直被期望能成为一种低成本的清酿酒翻技2004年第5期(总第125期)Liquor-making Science TechnologyNo.52004Tol.125洁燃料而取代汽油现阶段汽油中添加MTBE( methyl tertiary bully段的快速发展,可得到更多产乙醇的基因工程菌。通过代谢工程手ether)以提高汽油的清洁性,但现在发现MTBE对地下水有污染叫。段增加或修饰一些特点,例如乙醇或阻遇子忍耐性的增加,半纤维水和未被充分利用的纤维素物质成了生产燃料酒精的低成本素的水解及耐热性提高及对营养需求的进一步减少,对糖的代谢原料。半纤维素经预处理和酶解后都会产生混合糖混合糖根据来能力的进一步改进,可获得具有乐观前景的工业菌株,但还需要改源的不同包括木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、海藻糖和鼠李糖。进发酵过程中的工艺过程。尽管传统的酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)和絮凝性细菌参考文献:(2 momonas mobilis)可轻易将葡萄糖发酵为乙醇,但却不能将木[1]孙迅,王宜磊,邓振旭半纤维素生物转化研究进展[]微生物学杂糖和阿拉伯糖发酵为乙醇。酵母( Pachysolen tannophilus)、毕赤酵志,1997,17(1):50-55母( Pichia stipiti)和假丝酵母( Candida shehate)具有将木糖发酵(2] Badal c sah; Hemicellulose bioconversion(. J Ind Microbiol为乙醇的能力。但这些酵母如用于商业生产燃料乙醇却有诸多Biotechnol2003,30:279-291的弊端,如:它们的乙醇耐受力低,发酵率较慢及发酵过程中供氧[3]邬义明,等植物纤维化学[M]北京:轻工业出版社,1991不好控制,另外还有它们对纤维素底物的水解和预处理过程中产[4]EdS, Ohnishi A Kato K. Xylan isolated from the stalk o生的阻碍物敏感凹。木糖尽管可以用糖异构酶转化为传统酵母可Nicotiana tabacum[J]. Agric Biol Chem, 1976, 40:359-364.发酵的木酮糖,但其成本较高。而其他一些戊糖如阿拉伯糖等几s] Saulnier L marot C, Chanliaud E, Thibault JF. Cell wall polysac-乎没有自然存在的酵母可以发酵。charide interactions in maize bran[J]. Carbohydr Polymers, 1995, 26些细菌可利用这些混合糖。例如:大肠杆菌( Escherichia279-287col)克雷伯菌( Klebsiella欧文氏菌Enna)、乳杆菌( LLactobacil[6] Shibuya N, masaki t. Structural features of rice branlus)细菌( Bacillus)、梭状杆菌( Clostridia)等。但它们只能产生少量的hemicellulose[J]. Phytochemistry, 1985, 24: 285-289乙醇而产生的大部分都是一些混合酸和有机溶剂因此我们可以7] Doner LW, Hicks KB. Isolation of hemicellulose from corm fiberby alkaline hydrogen peroxide extraction [J]. Cereal Chem, 1997,采用细菌、酵母重组菌,通过代谢工程来发酵纤维素物质以生产燃74:176-181料乙醇。代谢工程指直接采用重组DNA技术对菌株进行改进,如(8] Thomson JA. Molecular biology of xylan degradation[J.FNs引入特殊的基因修饰(修饰基因的启动子)进行基因的删除或导Microbiol Rev. 1993. 104: 65入新的基因或途径到细胞中去,以改变细胞的产物或改善细胞的(9)SunY, Cheng J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol性能。它也称途径工程吗。production[J]. a review. Bioresour Technol, 83:1-I1.一些基因包括大肠杆菌的K011,SL40,FBR3及絮凝性细菌[10] Duff SJB, Murray WD. Bioconversion of forest products industry的CP4p2B5和酵母属的140(LNH32)等被重组后发酵玉米纤维waste cellulosics to fuel ethanol[J]. a review. Bioresour Techno水解糖,结果显示其可在玉米纤维发酵糖浓度在21-34g/L的范围内将之转化为乙醇产量为041-0.5g乙醇/g糖。最近 Nichols] Bjerre AB. Olesen AB,, Enqvist, Ploger A. Pretreatment of将葡萄糖磷酸转移酶(PsG)的基因导人到大肠杆菌中,使之可以wheat straw using combined wet oxidation and alkaline hydrolysis同时发酵葡萄糖、木糖、阿拉伯糖的混合糖,乙醇产量可达理论值resulting in convertible cellulose and hemicellulose[J].Bioresour的87%-94%。 Martinez报道通过启动子取代和使用多拷贝基因Technol,199649568-577可增加基因表达,即可消除导入乙醇基因后的大肠杆菌对高浓度12】 Bachmann SL, McCauthy AJ. Purification and cooperative activityof enzymes constituting the xylan-degrading system of Thermom-复杂营养物的需要。大肠杆菌经基因重组后对乙醇的忍耐力有所onospora fusca[J]. Appl Environ Microbiol, 1991, 57: 2121-2130.提高可耐受6%的乙醇。重组的絮凝性细菌被导人了4种基(3 Saha BC, Bothast R. Fuel ethanol production from com fiber因,分别为大肠杆菌[xyA( xylose isomerase)、xylB( xylulokinase)、alcal prospects[J]. Appl Biochemtransketolase), tktA( transketolase),可以木糖为唯一碳源生产乙醇Biotechnol1998,72115-125.产量可达理论值的86%。Deng和Ho证明了磷酸化是通过戊[14] Saha BC. Bothast RI. Pretreatment and enzymatic saccharification糖磷酸途径代谢木糖的重要一步。来自于酿酒酵母的XKS基因of corn fiber[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 76: 65-77.和来自毕赤酵母的XYL和XYL2的一种基因被导入一个混合主15]谢丽萍,王正祥诸葛健利用可再生资源生产酒精的细菌、酵母中体当中,此混合主体是通过 Saccharomyces ubarum和糖化酵母的代谢工程[]食品与发酵工业,27(12):63-68.c)的传统育种获得的这一重组产生了61ms聊pb母属( Saccharomyces)的pLNH32基因,其可在以木糖为唯一碳源的环境中生长井产生乙醇。ethanol production[J]. J and Microbiol, 1998, 20: 132-138尽管用微生物发酵半纤维素生产乙醇仍存在一些障碍,但世17hmgM,EdyC. Deanda K, Finkelstein M. Metabolic]engineeing of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas界的各个研究小组在不断地努力,应用代谢工程作为工具选育出mobilis[J ]. Science, 1995, 267: 240-243一些菌株,可有效而经济地将半纤维素水解液中的各类糖类转变18 Deng Xx, Ho NWY. Xylulokinase activity in various yeasts incl为有用的产物。最近的大部分研究集中在絮凝性细菌( AmabilisSaccharomyces cerevisiae containing the cloned xylulokinas大肠杆菌(E.col)、酿酒酵母( S cerecisiae)上。、随着基因工程研究手中国煤化工905:19319CNMHG欢迎订阅《酿酒科技》