微生物选育技术在生物燃料乙醇生产中的应用

第27卷第5期可耳生能Vol 27 No 5009年10月renewable Energy Resources0ct.2009微生物选育技术在生物燃料乙醇生产中的应用张敏,刘庆玉,陈东雨,李金洋(沈阳农业大学丁程学院,辽宁沈阳110161)摘要:随着全球性能源危机、粮食危机和环境危机的到来燃料乙醇作为汽油的替代品日益受到关注。应用微生物发酵技术将甘蔗、玉米、木薯和纤维类废弃物等转化为燃料乙醇已成为解决世界能源危机的一条理想途径。通过对环境中各种微生物进行筛选分离和育种,可以得到转化能力较强的高效菌株,将这些高效菌株应用于燃料乙醇生产中,能够有效提高燃料乙醇的生产效率。文章对微生物选育技术在燃料乙醇生产中的应用进行了总结与展望。关键词:菌种选育;生物质能源;燃料乙醇中图分类号:TK6;Q93文獻标志码:A文章编号:1671-5292(2000050052-03Application of microorganism selecting and breeding technologyin the production of fuel ethanolZHANG Min, LIU Qing-yu, CHEN Dong-yu, LI Jin-yangCollege of Engineering, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)Abstract: With the forthcoming of the crises of global energy, food and environmental, more andmore attention has been focused on fuel ethanol, which will be the substitute of gasoline. The con-version of sugarcane, com, cassava and fiber waste to fuel ethanol by microbial fermentation techniques has become an ideal approach to settle the worldwide energy crisis. the strains of high efficient and strong conversion ability could achieved by separating and breeding microorganism inthe environment. Production efficiency of fuel ethanol was effectively improved by applying theseand breed technology for the production of fuel ethanol was illustrated and forecasted selectingmicrobial strains to production of fuel ethanol. In this paper, application of microorganiKey words: strain breeding: biomass energy; fuel ethanol0引言研究,如日本的“阳光计划”、美国的“能源农场”和目前,现代社会赖以生存与发展的化石能源巴西的“酒精能源计划”等。我国是一个生物质正日渐枯竭,已成为制约未来社会发展的潜在危资源丰富的国家,利用现代技术将生物质转化为机。开发清洁的可再生能源是解决能源危机、减少高效洁净方便的高品位能源,对缓解能源危机环境污染、走可持续发展道路的重要途径之一。生食品短缺和环境污染等状况,促进社会经济的可物质资源是人类赖以生存的基本物质来源,其中持续发展和生态环境的改善都具有重要意义。仅10%被人类利用作为食物和工业原料,而90%纤维素的降解是纤维素利用过程中最主要的的生物质资源未被人类充分利用。自20世纪70化学反应。纤维素降解主要包括酸降解碱降解年代以来,工业发达国家对生物质能开展了许多氧化降解和微生物降解等几种类型,其中利用微收稿日期:200905-19中国煤化工基金项目:沈阳农业大学青年教师科研基金资助项目(20081005)。CNMHG作者简介:张敏(1978-),女博士,讲师,主要从事农业生物环境与能源ror-mau:uuunung412@163.com5敏,等微生物选育技术在生物然料乙醇生产中的应用生物所产纤维素酶对纤维素进行降解是最理想、变纤维单细胞菌,得到1株抗阻遏突变株M7,使最有效的途径,也是当今纤维素降解研究的热酶产量成倍提高。曲音波利用筛选到的斜卧青点。微生物是对纤维素进行生物处理的主体,因霉进行抗阻遏诱变,突变株JU1的滤纸CMC酶此,只有掌握了微生物的基本生理特性、分离筛活分别达到33,234mg/(mLh門。冯培勇以1株选方法才能培育出髙效的优势菌种,获得较好的绿色木霉为出发菌株,经过亚硝基胍、硫酸二乙酯处理效果。和氯化锂诱变处理后,得到1株产酶活力较高的1微生物选育的意义菌株L6,其酶活较出发菌株提高了35.7%。张秋生物质转化生成的糖类主要有葡萄糖、木糖、卓以里氏木霉ZM-4为出发菌株,研究了紫外诱阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖。充分利用这5类糖,变、硫酸二乙酯诱变以及紫外与硫酸二乙酯复合是获得高乙醇产率的关键。开发可发酵混合糖的交替诱变等不同诱变方法对其产纤维素酶能力的微生物,是促进生物质转化为乙醇工艺发展的关影响,结果表明,复合交替诱变的正突变率最高,键。因此,要想充分发挥微生物在纤维素转化为乙达45.98%,其中突变株ZM4F3具有最高的产酶醇中的作用,提高其酶活力,除了进一步改进工艺能力,比出发菌株ZM-4提高了1975%,在对外,更重要的是要加强高效菌株的选育工作,改良ZM4F3进行6代连续培养后,仍能保持较髙及菌种,以获得适应能力强、产酶活性高、可以大规稳定的产酶能力,可以应用于工业生产。毛培宏模应用的高效工程菌将低能N注入枯草芽孢杆菌Hy2中,选育出了2燃料乙醇生产中菌株的选育方法CMCase和FPA分别提高25倍和41倍的纤维菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自素酶组成型突变株Hy2-331,并研究了Hy2然选育,根据遗传学基础理论和方法,人为引起的3311的酶系组成和酶学性质,发现Hy2-311的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育酶系发生了很大的变化,并且各酶纯组分的酶学种、原生质体融合、基因工程等技术。性质也发生了变化,不仅提高了对可溶性纤维素2.1自然界筛选与驯化的降解能力,也提高了对不溶性纤维素的降解能从自然界直接分离筛选出高产乙醇降解菌株力两。武秀琴以黑曲霉为出发菌株,通过紫外线是育种工作中最经济实用的方法。吴海龙通过对(15W,照射距离30cm左右,照射时间8min)和秸秆和牛粪干的增殖培养,从中分离出42株菌硝酸的复合诱变,复筛得到纤维素酶高产菌株,纤株,经滤纸条崩解试验、溶菌圈大小测定及CM-维素酶活力提高了6110%,滤纸酶活力提高了Case(羧甲基纤维素酶活)测定,筛选得到1株代64.01%叫。号为GNA120,对纤维素降解具有优势的放线菌吲。23原生质体融合技术育种王敏釆用富集培养法,在高温条件下对酵母细胞原生质体融合技术广泛应用于各类微生物遗进行培养,通过筛选得到1株在45℃高温下生长传育种中,其作为一种更为随机的基因重组方式,良好的菌株,发酵温度为42℃,且发酵能力较强,能够克服细胞壁这一天然屏障,排除接合型的限72h失重为69g。制,实现多基因重组;还可直接采用生产性状好的22诱变育种菌株作为亲本,加速工业菌种改良进程,为燃料乙诱变育种是利用物理或化学的方法(如紫外醇微生物菌种的选育提供了一条崭新的途径。毛线、X-射线、Y-射线、亚硝基胍、微波等诱变剂)处华进行了 pickiastipitis和 Sacchromyces cerevisi-理微生物群体,促使少数个体细胞遗传物质(主要a属间原生质体融合融合子能发酵木糖产生酒是DNA)的分子结构发生改变,使基因内部的碱精,其在厌氧环境下发酵木糖和木糖一葡萄糖混基配对发生差错,从而引起微生物的遗传性状发合液的能力明显优于亲株,耐乙醇能力也比Pk生突变使人们可以简便、快速地筛选出各种类型 lastiputLs有所提高。 Kordowska通过研究表明,毕的突变菌株赤酵中国煤化工乙醇能力高于毕目前这方面研究的报道较多,采用的诱变手赤酵CNMHG率有所下降段各异,均取得较好的效果。wart首先用Uv诱也有把h〔H与冒獲阵切屜合起来,得到的可耳生能漁2009,27(5)融合子的耐乙醇能力有所提高,但产乙醇能力没糖→3-磷酸甘油醛+乙酰磷酸→乙酰CoA→乙有提高四。张华山以糖化酵母和酿酒酵母为亲醛,重组酵母降低了副产物木糖醇的量,乙醇得本,采用单亲灭活原生质体融合技术进行属间融率比亲株提高25%。合,同时对酵母原生质体的形成和再生条件进行3结束语了探索,取培养6-8h的单倍体,在30℃条件下虽然通过菌株的筛选以及基因工程等手段使用20%的蜗牛酶酶解Ih时,其形成率超过乙醇产量得到了提高,但是纤维素原料的水解以92%,对双亲与融合子的细胞大小、DNA含量、淀及发酵木糖生产酒精的工业化仍存在许多挑战性粉利用率及产酒精能力等进行了比较研究,利用问题,因此还须要深入开展复合诱变剂处理微生获得的融合子发酵可溶性淀粉,其乙醇得率可达物的诱变育种、基因工程育种技术以构建出能大6.5%。规模应用于工业的高效工程菌等研究工作。采用2.4基因工程育种各种选育燃料乙醇微生物菌种的方法,得到优良基因工程育种是指利用基因工程方法对菌株的菌株,将大幅度地提高乙醇的发酵产率及乙醇进行改造来获得高产工程菌,或者通过微生物间产业的经济效益,对推动乙醇发酵工业的发展具的转基因来获得新菌种的育种方法。与前两种育有重要的现实意义。种技术相比,基因工程育种具有很好的定向性,为构建髙效燃料乙醇生产菌开辟了新途径,最有可参考文献能使纤维素的分解利用问题得到突破性解决。[1 SHETTY J K, O J LANTERO, N DUNN-COLEMAN胡仕风利用限制性内切酶介导的基因整合Technological advances in ethanol production [J).Int技术(REMI)转化 T koningii CICC40144,共获得Sugar.J.,2005,107:605-60623个稳定的突变株,经筛选获得了1株高产纤(2]吴海龙张立青方萍一株产纤维素酶的诺卡氏属菌维素酶木霉突变株TK-2R-14,其Cx酶活达株筛选及产酶条件研究门科技通报,2008,24(6):376UmL,比出发菌株提高805%,FPA酶活达3王敏,朱会霞,路玲玲,等高温酵母的分离及其特性169U/mL,比出发菌株提高1901%叫。为了使大研究门中国酿造,2006(11):38-41.肠杆菌能够代谢葡萄糖和木糖产乙醇,李学风将4] STEWART B J, J M LEATHEWOOD Derepressed syn运动发酵单胞菌乙醇发酵途径中的关键酶基因thesis of cellulose by Cellulomonas [J]. Bacteriol丙酮酸脱羧酶基因与质粒载体pGM-T连接转化1976,128:609-615.至大肠杆菌TOP10中,丙酮酸脱羧酶基因在T7S曲音波高培基,王祖农青莓的纤维素酶抗降解物阻启动子的启动下得到了高效表达,构建的重组大遏突变株的选育(真菌学报,1984,3(4):238-242肠杆菌不但可以利用葡萄糖和木糖产乙醇,而且冯培勇葛宜和杨立红,等化学诱变选育高产纤维素酶菌株安徽农业科学,2008,36(33):14378当葡萄糖和木糖同时存在时,优先利用葡萄糖吗。14379Mogagheghi将木糖和阿拉伯糖代谢所需的7个张秋卓蔡伟民纤维素酶高产菌株的复合交替诱变酶基因整合到运动发酵单胞菌的染色体上,产生选育工业做生物,2008,38(6):32-37.的工程菌可发酵40gL葡萄糖、40g/木糖和2018毛培宏,金湘曾宪贤,等新疆离子束牛物技术的研g/L阿拉伯糖的混合发酵液,在50h内消耗完葡究门生物技术,2003,13(4):50-51萄糖和木糖以及75%的阿拉伯糖,乙醇得率为9武秀琴,王敏纤维素酶高产南株的诱变选育小安徽043~046gg。 Shigechi利用细胞表面工程构建农业科学,2008,36(23):9817-9818表达了α-淀粉酶和糖化酶的酵母,利用生淀粉10毛华,曲音波,高培基,等酵好属间原生质体融合改发酵产生乙醇该酵母能在72h内产生61.8g/L进木糖发酵性能小生物工程学报,1996,12:157-162乙醇,是生玉米淀粉理论收率的86.5%。Son[1l] KORDOWSKA W M, TARGONSKI Z Application ofSaccharomyces cerevisiae and Pickia stipitis karyoduc-deregger将外源的磷酸乙酮醇酶基因、磷酸转乙中国煤化工 rom xylose]Ac酰酶基因、乙醛脱氢酶基因引入代谢木糖的酵母工程菌,从而引入一条新的途径:5-磷酸木酮(12】WCNMHGm。(下转第60页)可耳生能源2009,27(5)terials for ethanol production: a review [J]. BiorTechnology, 2002, 83: 1-11.[ 37] HOFFMANN M. 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