用聚乙二醇分离富集microRNA的方法探讨

医学分子生物学杂志，2009. 6 (6): 518-520 JMed Mol Biol, 2009, 6 (6): 518-520DOI: 10. 3870/j. issn. 1672-8009. 2009.06.010用聚乙二醇分离富集microRNA的方法探讨骆明勇，钟华敏广州市妇女儿童医疗中心儿童医院检验科广 州市, 510120[摘要]目的 探讨用聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG) 溶液分离富集miRNA的操作方法和分离富集效果，并与Ambion公司的miRNA分离试剂盒分离效果进行比较。方法用 PEG溶液和Ambion公司的miRNA分离试剂盒从肝脏组织总RNA中分离商集miRNA,用变性琼脂糖和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分离效果，并在富集的miRNA中用RT-PCR扩增miR-122以鉴定是否有效地回收了miRNA。结果PEG 和Ambion公司的miRNA分离试剂盒都能有效地富集miRNA,PEG富集的RNA片段比Ambion公司的试剂盒的大。结论PEG 溶液能有效地分离富集miRNA,和Ambion公司的miRNA分离试剂盒分离效果相当，并具有操作简便、快捷及成本低廉的优点。[关键词] microRNA; 聚乙二醇; miR-122[中图分类号] Q522Isolation and Enrichment of MicroRNA by use of Polyethylene GlycolLUO Mingyong, ZHONG HuaminLaboratory Department of Children's Hospital ，Guangzhou Medical Center for Women and Children,Guangzhou, 510120, China[Abstract]Objective To develop approaches for isolating and enriching microRNA with Poly-ethylene Glycol ( PEG)，in comparison with the microRNA isolation kit produced by Ambion com-pany. Methods microRNA isolation and enrichment were performed in liver tissue with PEG andAmbion microRNA isolation kit. The products produced with two methods were evaluated by electro-phoresis on denatuing agarose gel and denaturing polyacrylamide gel. miR-122 was detected by RT-PCR in the enrichment fraction to verify the recovery of microRNA in isolation process. ResultsPEG method was able to successfully enrich microRNA, similarly to Ambion microRNA isolationkit. The RNA fragment enriched by PEG was larger than that obtained by Ambion microRNA isola-tion kit. Conclusion PEG can enrich microRNA as efficiently as Ambion microRNA isolation kit,with advantage of easy and quick manipulation and low cost.[ Key words]microRNA; polyethylene glycol; miR-122microRNA ( miRNA)是一组生物体基因组编茎环结构的逆转录引物的RT-PCR方法也被发展了码的内源的非编码小RNA ( non-coding small起来，大大地提高了miRNA检测的灵敏度[5。但RNA),广泛分布在动植物及病毒等生物体中。研由于miRNA在细胞或组织中含量非常低，从总究表明，miRNA 与动植物的发育、细胞生长分化RNA中富集miRNA是miRNA实验中- -个重要的步和凋亡、脂肪代谢以及人类重大疾病密切相关，近骤。目前，-些生物技术公司已开发出了一些用于年来成为了生命科学的研究热点!14。分离富集miRNA的商品试剂盒，分离效果好且使随着生命科学研究的发展，miRNA 研究方法用方便，但是价格昂贵。在本研究中，我们拟对采层出不穷并不断地得到改进。研究方法有克隆表用聚乙二醇( polyethylene glycol, PEG) 分离富集达、Northerm 印迹及生物芯片等; -种新的采用带miRNA的方注进行探过中国煤化工通讯作者:骆明勇(电话: 020-81330633. E-mail: luo-my@ 163.HYHCNMHGCoreponding author: LUO Mingyong ( Tel; 86-20-81330633， E-1.1试剂和仪器mail: luo-my@ 163. com)PEG 6000和氯化钠购自加拿大BBI公司;人肝医学分子生物学杂志，2009, 6 (6): 518-520 J Med Mol Biol, 2009, 6 (6): 518-520●519●脏组织总RNA和miRNA分离试剂盒( mirVana miR-表1 miR-122 和U6 RNA的RT-PCR引物NAisolationkit)购自美国Ambion公司;糖原购自引物序列(5'→+3')美国Invitrogen公司;低分子量DNA marker购自美miR-122 RT 引物GTCGTATCCAGTCCAGGGTCCGACG-TATCCCACTGGATACGACACAAAC国NEB公司;垂直电泳槽和电泳仪购自美国Bio-PCR引物‘正向: GCCGTGGAGTGTGACAATCGTRad公司; PCR仪购自美国MJ Research公司;低温反向: GTGCAGGGTCCCAGGT台式离心机购自德国Eppendorf公司;寡核苷酸在英U6 PCR引物 正向: CTCCTCCCAGCACA骏(Invitrogen) 公司合成。反向: AACGCTTCACATTTCCGT1.2实验方法1.2.1 PEG 6000 溶液的配制 分别称取PEG2结果6000 13.0g,氯化钠9.36 g溶于100 ml DEPC处理2.1 miRNA 富集后的电泳鉴定液中。PEG的终浓度为13 % (m/v), 氯化钠的终肝脏组织总RNA和富集后的LMW掘NA、浓度为1. 6 mol/L。溶解完后用0.2 μm滤器过滤，HMWRNA的甲醛变性琼脂糖电泳和变性聚丙烯酰4 C保存备用。1.2.2肝脏组织 miRNA的富集过程PEG 6000胺凝胶电泳结果见图1和图2。溶液富集miRNA的方法简要过程为:在肝脏组织AB总RNA (1 μg/μl) 100 μl溶液中加入等体积的28sPEG 6000溶液，室温放置10 min;然后在4 C,12 000 r/min离心15 min。总RNA被分为两部分，18 s上清液即为低分子质量RNA ( low molecular weight18sRNA, LMW RNA),沉淀为高分子质量RNA (highmolecular weight RNA, HMW RNA);在上清中加5.8s入0.1倍体积醋酸钠(3 mol/L, pH 5.2)和糖原is5s(终浓度为1 ng/ul),再加入2. 5倍体积无水乙醇,图1甲醛变性琼脂糖(1.2%，各条带RNA上样量都-20 C放置1 h沉淀LMW RNA, miRNA就富集在为0.5 ug) RNA电泳图LMW RNA中。A: PEG分离电泳图; B: Ambion 公司miRNA分离试剂Ambion公司的miRNA分离试剂盒(mirVana盒分离电泳图miRNA isolatin kit)分离富集miRNA按照试剂盒1:总RNA; 2: HMW RNA; 3: LMW RNA说明书进行。1.2.3 miRNA分离富集结果的鉴定 分离后的134LMWRNA和HMWRNA各0.5ug用1.2%甲醛变.性琼脂糖RNA电泳和15 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定其分离效果。为了验证两种方法是否有效地富集回收了miRNA,我们在富集的样品中进行miRNA的RT-PCR实验。由于我们富集用的总RNA是肝脏组织tRNA总RNA,就选取在肝脏组织特异表达的miR-122图2变性綮丙烯酰胺凝胶(15 %)电泳图进行RT-PCR,并同时扩增U6 RNA。1:总RNA;2:PEG分离HMWRNA;3:PEG分离miR-122的RT-PCR简要过程为0:对miR-LMW RNA; 4: Ambion 试剂盒分离HMW RNA; 5:122设计--条带茎环结构的逆转录引物以及相应的Ambion试剂盒分离LMW RNA-对PCR引物(序列见表1);10μl逆转录体系中M-MLV逆转录酶100单位、50 nmol/L茎环结构从甲醛变性琼脂糖电泳图上可以看出用PEG的引物和U6 RNA逆转录引物、LMW RNA 10 ng;沉淀中国煤化工试剂盒都能将高逆转录后进行PCR, PCR 条件为95 C15s, 60 C分子质|Y片CNMHG8srRNA)有效30s，进行20个循环。同时在另- -管中扩增U6地去除，只可见5 S rRNA和5.8 S rRNA的条带,低分子质量RNA得到了很好的富集。同时变性RNA,U6RNA的PCR引物见表1。●520●骆明勇，等.用聚乙二醇分离富集microRNA的方法探讨PAGE电泳图上都可以清楚地看见，两个方法富集的、具有显著优越性的方法，在一般的RNA实验都可以清楚地看见L.MW RNA的tRNA、5 S rRNA室即可进行操作。和5.8S rRNA的条带，并且在HMW RNA中较少miRNA由于在细胞和组织中含量低，所以不看到5.8srRNA以下的RNA;PEG富集的LMW管是miRNA克隆、Northerm 印迹还是生物芯片检RNA条带的加样孔中的亮度比Ambion公司的miR-测都需要对总RNA进行分离富集。分离方法也层NA分离试剂盒分离的亮，并月PEG富集后HMW出不穷，最开始研究人员采用PAGE 电泳分离RNA条带中的剩余的5.8 S条带较暗，而AmbionmiRNA'),此方法难度大、复杂且操作繁琐;公司的miRNA分离试剂盒分离后的HMWRNA条Thomson等8率先采用PEG的方法分离富集miR-带中叮以较多地看到5.8 s RNA部分，说明PEGNA,取得了满意的结果。该方法具有操作简便、方法富集的低分子质量RNA部分包括有较多的成本低廉等优点，且不影响miRNA的后续反应,5.8S RNA部分。综上所述，两种方法都能有效地富集的miRNA可以进行各种酶学反应。近年来，富集低分子质量RNA (包括miRNA部分)，PEG生物技术公司开发出了各种miRNA分离试剂盒，富集的RNA片段比Ambion公司的试剂盒的大。这些试剂盒方便使用，为研究工作者提供了方便，2.2 miR-122的RT-PCR检测但是试剂盒都比较昂贵。本研究用PEG的分离方PCR产物的电泳图见图3。miR-122 的PCR产法和Ambion公司的miRNA分离试剂盒进行了比物长度为59 bp, U6的PCR产物长度为94 bp。从较，两种方法都能有效地分离富集miRNA,但RT-PCR结果可以看出，两种方法富集的低分子质PEG的方法具有成本低廉，操作便捷，为研究工量RNA中都能很好地扩增出miR-122和U6 RNA。作者提供了另一个较好的方法选择。说明两种方法都能有效地富集回收miRNA。在用乙醇沉淀回收低分子质量RNA时，加入糖元是必需的。糖元作为核酸沉淀的载体可以使bpJ6MiR-122miRNA不易丢失且操作更方便，糖元也可以用如766Takara公司的核酸共沉淀剂等替代。Ambion 公司500的miRNA分离试剂盒也是-个使用较方便的试剂350盒，但是价格较昂贵，另外我们在使用Ambion公200司的miRNA分离试剂盒的过程中也发现，由于试250剂盒的洗涤缓冲液在低温下容易析出盐结晶，如果1501009使用前溶解不充分就会将盐分残留在富集的miR-75NA中,从而影响后面的酶学反应。595(参考文献2:[1] BARTEL D P. MicroRNAs: genomies, biogenesis. mechanism, and图3肝脏组织 miR-122和U6 RNA RT-PCR电泳图function[J]. Cell ,2004 ,116(2) :281-297.[2] YANG M,LI Y, PADGETT R w. MicroRNAs: Small regultoswith a big impact[J]. Cyiokine Growth Factor Rev ,2005 ,16(4-3讨论5) :387 393.[3] WIENHOLDS E, PLASTERK R H. MicroRNA function in animaldevelopment[J]. FEBS Lett ,2005 ,579(26) :591 15922.2miRNA是近年来生命科学的研究热点，研究[4] MISKA E A How microRNAecontrcell division,frtition的方法也发展得较多，但由于miRNA在细胞和组and death[ J]. Cur Opin Genet Dev ,2005 ,15(5) :563-568.[5] CHEN C, RIDZON D A. BROOMER A J.et al. Real-ime quani.织中含量很低，所以miRNA大部分的的研究方法cation of microRNAs by stem-loop RT-PCR[ J]. Nucleic Acids都需要预先对其进行分离富集。本研究对PEG分Res ,2005 ,33(20) :e179.[6]骆明勇.杨戎，张亮，等.MicroRNA122对肝樹细胞基因表达离富集miRNA的方法进行了探讨，成功地摸索出谱的影响[J].中国生物化学与分子生物学报，200 ,23(8):644 -651.了用PEG 6000溶液离心沉淀分离miRNA的方法。[7] BASKERVILLE s. BARTEL D P. Micrarray profiling of micoR.鉴定结果显示PEG溶液能有效地分离富集miRNA,中国煤化工4i4neigboring miRNAs and并和Ambion公司的miRNA分离试剂盒分离效果相[8]Hal A cuslom microaray当，PEG分离富集的RNA片段略大于Ambion公司ods,2004,1(1) :47-53.的miRNA分离试剂盒。但PEC分离富集的方法具(00908-17收稿)有操作简便、快捷及成本低廉的优点，是- -种实用