高浓度发酵制备红薯燃料乙醇的研究

酿酒科技2008年第7期(总第169期) LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2008N.7Tl.169高浓度发酵制备红薯燃料乙醇的研究罗希,何华坤,刘莉,王红霞,晏涛,龚大春(三峡大学化学与生命科学学院湖北宣昌443002)摘要:研究了以鲜红薯为原料制备高浓度红薯燃料乙醇过程中高糖浓度和高酒浓度下酵母细胞生长特性和还原糖浓度变化规律。发酵醪中添加活性物质,可以减小发酵液的渗透压,提髙酵母的耐酒精能力。通过4因素3水平正交实验优化,鲜红薯高浓度发酵酒精度可达到15.%vol,吨酒精水消耗控制在6t左右,咆酒成本可降低200元关键词:燃料乙醇;红薯;高浓度发酵;酵母中图分类号:TS2622;TS2614文献标识码:A文章编号:1001-9286(2008)07-0032-04Research on High Gravity Fermentation for the productionof Fuel Alcohol by Sweet PotatoesLUO Xi, HE Hua-kun, LIU Li, WANG Hong-xia, YAN Tao and GONG Da-chun(Chemistry Life Science College of Three Gorges University, Yichang, Hubei 443002, ChinaAbstract: The growth characteristics of yeast cells and the change rules of reducing sugar concentration under high concentration of sugar andalcohol in the production of fuel alcohol by fresh sweet potatoes were investigated. The addition of bio-active substances in fermenting mashcould reduce the osmotic pressure of fermenting liquid and increase ethanol tolerance of yeast. Through orthogonal experiment L,(3"), the alco-hol concentration of fermenting liquid was up to 15.1 %vol, water consumption for per ton alcohol controlled at about 6 t, and the productioncost reduced by 200 RMB for each ton of alcohoL.Key words: fuel alcohol; sweet potato; high gravity fermentation; yeast化石资源作为一种不可再生的资源已日益枯竭,寻母在特殊环境下的生长能力,最终实现红薯的高浓度发找可再生的替代资源和能源,特别是新的液态燃料,成酵。期望降低发酵过程的水的消耗和精馏过程的能源消为维持人类社会可持续发展的迫切需要耗乙醇是来自可再生资源的最有发展前景的液态燃1材料与方法料。在汽油中添加10%~15%酒精组成的乙醇汽油,已在我国东北、北京、上海、河南、湖北等地试用。“十五11原料期间我国燃料乙醇产量达到130万t左右。但我国燃料红薯:产地湖北宜昌,DNS法检测得淀粉含量26%乙醇的生产主要用过剩粮食玉米、小麦生产,原料紧缺,以上,选择成熟好淀粉含量高、无霉烂、无病虫害的鲜并容易引发粮食价格上涨,因此拓展生物质原料,利用红薯。非粮食的淀粉生物质或非淀粉的纤维素生物质作为原12主要试剂料,生产燃料乙醇,意义重大。高淀粉红薯是一种工业用酵母抽提物、耐高温活性干酵母为安琪酵母股份有的能源作物其淀粉含量在30%左右,用于制备燃料乙限公司提供。耐高温a-淀粉酶(不小于4000g),北京醇是南方地区开发生物能源的绝好原料。但其工艺主奥博星生物技术有限责任公司;糖化酶(500ug),湖要借用玉米乙醇工艺,存在废水排放大、分离能耗高等南省津市市新型发酵有限责任公司。其他为国内常规试问题剂本文以高浓度发酵原理为指导,通过添加活性物13主要实验设备质,减小酒精抑制降低高糖浓度引起的渗透压,提高酵基金项目:宜昌市科技攻关项目(A2007103-1)TYH中国煤化养箱(上海博迅实业CNMHG收稿日期:200804-14作者简介:何华坤(1986-),男,大学本科生。通讯作者:龚大春(1967-),男,生物化工博士,副教授硕士生导师,主要从事生物质能的研究与开发以及手性化合物的合成技术研究罗希,何华坤刘莉王红霞,要涛典大春·高浓度发酵制备红薯燃料乙醇的研究有限公司医疗设备厂)紫外/可见光分光光度仪(上海1.8美谱达仪器有限公司),GC气相分析仪(上海天美仪器1.61.4有限公司)等。1.214实验方法1.014.1DNs溶液的配制0.6取63g3,5-二硝基水杨酸溶于262mL2moL的氢氧化钠溶液中。再将此溶液与500mL含有182g酒0.2石酸钾钠的热水混合。向该溶液中再加入5g重蒸酚和5g亚硫酸钠,充分搅拌使之溶解,待溶液冷却后,用水葡萄糖浓度(ng/mL)稀释到1000mL。贮存于棕色试剂瓶中(需要在冰箱中图1葡萄糖标准曲线放置7d方可使用)般情况下,发酵醪液中酵母菌细胞的密度越高,142液体培养基定的时间、一定的容积内产生的酒精就越多,发酵效KHPO40.5%MgSO40.2%、NaC10.%、CaCl2率就越高。但在一般的间歇发酵工艺中受发酵醪液中02%、NHSO05%,酵母抽提物0~10%,生物活性营养物质的含量酒精代谢产物浓度及酵母菌自身生理物质0~03%,蛋白陈1%。和遗传等因素的影响醪液中的酵母菌细胞密度会有15分析检测方法个极限值。对于高浓度酒精发酵来说,由于发酵醪液中1.5.1还原糖的葡萄糖的浓度比一般的发酵醪液中高出很多,此时加采用DNS法测定人酵母菌的数量也应该比一般的间歇发酵醪液中要多,1.52pH值但是考虑到生产成本以及酵母菌个体间的相互影响,酵采用酸度计测定。母菌细胞的密度应该增加到一个合理的范围内,从而防1.5.3乙醇含量的测定止酵母菌因为过量增殖而消耗多余的原料糖,同时又能取出成熟发酵醪在600rmin离心机中离心保证酵母菌细胞正常生理代谢所需要的糖,实现良性发5min。用045μm过滤器过滤得到的液体样品采用气酵代谢。图2是以活酵母数为纵坐标,反应时间为横坐相检测。标绘制的酵母在50h内的生长曲线图。1.54红薯中淀粉含量的测定取试样15~2g,研碎,转人250mL三角瓶中,加5.5人100mL2%盐酸溶液。瓶口上安回流冷凝器或长玻璃管,沸水浴3h。取出迅速冷却。用20%氢氧化钠溶液中X←曲批和至中性或微酸性。滤纸过滤滤液用500mL容量瓶接3.5收,用水充分洗涤残渣,然后用水定容,用DNS测溶液中糖含量,从而可折算出红薯原料中淀粉含量。1.5.5水分测定将红薯洗净切碎,取10g放入蒸发皿中,于干燥箱时间〔h)中105℃温度下干燥过夜,直到恒重为止。图2计数观察酵母生长曲线2结果与分析由图2可以看出,酵母的主要生长阶段在21h内21葡萄糖标准曲线的绘制此阶段酵母生长最快、活细胞数量增加最多、在21h时通过线性回归,得到葡萄糖浓度对吸光度的线性方产酒能力最强是发酵的主发酵阶段。在32h后,酵母程为细胞数量明显减少。OD=1868167C-0.01193R=0.997992.22还原糖浓度变化式中:C为葡萄糖的浓度,mgmL,糖的浓度可以根据测得的OD值和稀释倍数对应求出。淀粉含量根据还原糖的量折算。行糊中国煤化工淀粉和100水,进活5min,调pH值至葡萄糖标准曲线见图1。4.2。CNMHG糖化4h加入液体培22鲜红薯高浓度酒精发酵的影响因素冈养基(未加生物活性物质)中。调pH40~50,接种活化22.1酵母菌细胞密度34米酿酒科技2008年第7期(总第169期) LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2008N.7(Tol.169过的酵母05%。每3h测1次还原糖浓度并记录实验母在高底物浓度下的发酵过程正常进行。数据,结果见图3。2.25正交实验在液化和糖化及各营养成分优化的实验结果的基础上,对不同酵母量、抗酒精试剂、酵母抽提物和抗渗透压试剂的添加进行4因素3水平正交实验。因素水平表见表l。实验结果见表2。表1试验因素、水平水平醉母抽提物抗酒精试剂酵母量抗渗透压试剂0A(%)C(%)时间h)123357B20.40.5m2图3还原糖浓度变化曲线由图3可以看出,随着发酵过程的进行,发酵液中序表2正交试验因素水平表L,(3),发酵72h的还原糖不断被酵母利用产生酒精实验开始阶段酵母号ABCD(xL,20c)糖(3)()活性强、产酒精较快,发酵后期酵母由于环境的变化,酵母活性下降、产酒精能力降低,而且残留的还原糖在522122213106668h时仍有3mgmL左右。还原糖浓度变化最快的时间在2313.30.4167.80h与22h之间,此时还原糖浓度急剧下降,是酵母发522320.9363酵产生酒精的主要时期。620.8266.3732.71.264.7223抗酒精的抑制作用832213.20.6667.3酒精是酵母菌的代谢产物,其会对酵母菌产生毒害912.60.7164.作用。随着发酵醪液中酒精浓度的增加,乙醇可以进入K16.7064.8865.1763.30到细胞膜的疏水区降低了疏水介质的相互作用力。另826593690627659外,乙醇在疏水区的存在还会降低范德华力的作用,增R0.5661.4341.1004.467加细胞膜的运动性和疏水区的极性,使细胞膜减弱对极F1.006.8323.81962.109F=19性分子自由交换的疏水性障碍作用。因此,在实验中添加抗酒精试剂,保护酵母细胞膜的活性物质如聚多糖由表2极差结果分析表明:4个因素的最佳组合是异黄酮海藻糖和Twen80等,可以有效保护细胞膜A2B3C2D3,即:酵母抽提物4%,抗酒精剂B2,酵母量的疏水区域,提高细胞的耐酒精能力。添加0.5‰~4%,抗渗透压试剂D3。它们对发酵的影响程度为:抗1%的生物活性物质,可以将酒精度提高5%vol。渗透压试剂>抗酒精剂>酵母量>酵母抽提物。可见在224渗透压的影响高浓度发酵过程中降低高浓度葡萄糖引起的渗透压和高浓度发酵制备红薯燃料乙醇的第一个关键是如提高酵母的耐酒精能力是实现高浓度发酵制备红薯燃何在高葡萄糖浓度和高乙醇浓度下使酵母保持良好的料乙醇的关键。通过方差分析发现抗渗透试剂的选择繁殖状态。在高浓度下发酵液中的渗透压会升高,使酵非常重要,是实现高浓度发酵的显著影响因素。其F比为母细胞变形甚至使酵母营养物质从膜内流失到膜外,最62109,远大于F临界=19后导致酵母死亡。同时高乙醇浓度也会对酵母产生毒226最佳发酵工艺的验证性。因此,在发酵培养基中必须添加生物活性物质,一方用本实验所确定的最优培养基成分、最优液化、糖面降低发酵液中的渗透压,改善酵母的代谢环境,另化条件、最适底物浓度、最适发酵条件进行发酵。方面提高酵母细胞持续的生长能力和在短时间内产生取一个锥形瓶,加入经蒸煮、研碎的红薯20g,加水高浓度的乙醇。比为12进行糊化。加入a-淀粉酶1%,于70℃水中液实验研究表明在高浓度发酵中加入多元醇抗渗透化2b灭活5m调H值42加糖化酶1%,于60℃压试剂啊如麦角甾醇、山梨醇等,使酵母菌生长良好,可水中中国煤化工透压试剂D和抗酒精以部分起到抵抗高浓度葡萄糖所造成的渗透压的影响,剂BCNMHG~45,接种用2%的葡使酵母菌的发酵强度处于较高的水平。添加005%的萄糖溶液活化过的酵母1%,控温发酵72h。发酵实验多元醇,可降低葡萄糖高浓度引起的高渗透压,保证酵结果为:残糖为042%;酒精度为15%0;出酒率为罗希,何华坤,刘莉,王红霞,要涛,粪大春·高浓度发酵制备红薯燃料乙醇的研究76.5%。参考文献3结论[]龚大春,田毅红李德莹龚美珍纤维素乙醇的研究进展门化学与生物工程,2007,(1):4-73.1实验通过解决红薯燃料乙醇的浓醪发酵系列关键2]姜勇,李春玲,孙承国等对玉米生产酒精过程中酵母影响问题,构建高浓度发酵制备红薯燃料乙醇新技术。通因素的研究门酿酒科技,2006,(3):91-93过添加活性物质减小渗透压,缓解渗透压对酵母产酒3]沈力匀工业发酵分析[M北京:中国轻工业出版社,的影响,提高了酵母的抗酒精抑制作用。最终实现了红1980.15-17薯的高浓度发酵,将发酵酒度提高到151%vol[4]陈坚高细胞密度发酵技术[M北京:化学工业出版社3.2采用鲜红薯直接液化糖化和高浓度发酵,可以使2006.109-130.吨酒精水消耗控制在6t左右,大幅度减少能耗,降低酒5] Reddy lv.a, Reddy O V.S. Rapid and enhanced pr精生产的综合成本,并减轻环保压力。据估算,如果将酒ethanol in very high gravity (VHG)sugar fermentation bySaccharomyces cerevisiae: Role of finger millet(Eleusine度从8%vol~10%vol提高到14%vol~15%vol,吨酒coracana L )flour[J] Process Biochemistry, 2006. 41: 726-729将减少蒸汽近1t,减少废水近4~5t,吨酒成本降低6侯保朝杜风光郭永豪,等高浓度酒精发酵[]酿酒科技,200元,10万t燃料乙醇将节约成本2千万元,同时减2005,130(4):93-97少废水排放,综合效益相当可观。2a品奶决况况况》》加加》》》加》加护护护》》》》加如器》(上接第31页)由图6~图8可知,基因工程菌株Y2的20代菌株现象严重,从而影响其抗氧化能力的稳定性。因此,采用的SO2生成量为21.51mg/L,TBA值为3678,DPH自酵母基因组整合表达SSU1解决基因工程菌株遗传稳由基清除率为70.3%,分别较第1代菌株下降329%,定性问题有待于进一步研究。升高9.0%,下降124%;而原株M8的20代菌株较第参考文献:1代菌株的SO2生成量、TBA值和DPPH自由基清除率[I] Robbins TL, Boillat B Control of odors in the brewing and food均无明显变化。结果表明,基因工程菌株Y2的遗传稳定processing industries[J]. MBAA TQ. 2002, 39: 29-31性比原株M8差。[2] Park H, Bakalinsky AT. SSUl mediates sulphite efflux in3讨论Saccharomyces cerevisiae[]. Yeast. 2000,(16): 881-888[3]丁书美陈叶福,肖冬光啤酒中HS测定方法的研究[酿实验表明,啤酒酵母基因工程菌株Y2中SSUI基酒,2006,33(6):94-95因得到多克隆活性表达,较原株啤酒酵母M8的SO2生4]丁书美陈叶福,肖冬光,等啤酒中SO2测定方法的研究[A成量提高808%,DPH自由基清除率提高382%中国发酵工程学术研究会论文集[C2006TBA值下降149%,HS生成量相差不大,啤酒发酵性[5]杜连祥等.丁业微生物学实验技术M]天津:天津科学技术能良好,抗氧化能力明显提高啤酒风味稳定性得到改出版社,1992善。由于本实验釆用酵母附加型表达载体,在无选择压]王丹红TBA值在啤酒风味稳定性预测中的应用门中国啤力的发酵条件下,不能稳定地存在于酵母细胞中。因此酒,2002,(9):44-46随着基因工程菌株Y2的不断传代,重组表达载体丢失7严敏李崎,顾国贤利用DPH自由基清除率评价啤酒内源性抗氧化能力门食品工业科技,2005,(8):82-83中联新型活用籽问嵫本刊讯:由四川省申联生物科技有限責任公司、四川省食品发酵工业研究设计院、四川省天府名优酒研究中心等几家科研单位利用超临界CO2萃取技术,有效提取丢糟、黄水、底锅水中的香味成分生产出的新型酒用香料,经多次实验证明,对提高酒质、增加酒体复杂微量成分有明显效果。传统浓香型曲酒发酵过程中,会产生丢精、黄水、底锅水等发酵副产物质。其中,丢糟是面糟发酵经固态蒸馏取酒后的残褘;黄水是发酵过程中在窖底形成的黄褐色淋浆水;底锅水是蒸馏过程中水蒸汽蕙发遇酒酷后,冷凝回落形成于锅底的蒸浆水。它们中+都富含大量的香味物质成分,有残淀、还原糖、有机酸、酯类、醇类、羟基化中国煤化工环类化合物等。但由于技术服制,酒厂都将其直接扔拌既没有经济效益,又污染环境。CNMHG据悉,从白酒发酵副产物中有效提取香味物质并将其转化为酒用香兀宀~刀,巴是未来白酒添加剂的发展方向。基于此,四川中联生物科技有限责任公司联合四川省天府名优酒研究中心、四川省食品发酵工业研究设计院等业内科研院所经过积契砑攻关,终于实现了鉍塹窄公息酒岑阡塑产中褪出査唪质矛转华玅潭厚(江源)-+→++-→++