聚乙二醇去细胞化组织工程带瓣管道的物理特性

第35卷第5期第659页华中科技大学学报(医学版)Vol.35 No.5 P. 6592006年10月Acta Med Univ Sci Technol H uazhongOct. 2006聚乙二醇去细胞化组织工程带瓣管道的物理特性蒋雄刚'徐鹏'韩啸!杨华静’张凯伦'I华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科,武汉4300222华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉430030摘要目的探讨聚乙二醇(PEG)法在生物带瓣管道准备中的应用价值,比较PEG去细胞前后带瓣管道的物理特性。方法猪主动脉瓣带瓣管道分为去细胞组和正常对照组,去细胞组用PEG和DNaseI处理,苏木精-伊红染色观察去细胞情况,DNA含量测定,计算去细胞百分率;猪主动脉带瓣管道条置于力学测试仪,测定最大负荷、最大应力最大应变和弹性模量。结果PEG 组去细胞百分率为95. 32%,去细胞猪带瓣管道组织中看不到细胞成分;且细胞外基质(ECM)结构保存完整,胶原纤维排列整齐,无明显断裂,仍呈波浪状平行排列,结构紧凑,弹性纤维结构清晰,组织无明显水肿。生物力学检测,与对照组比较最大负荷、最大应力、弹性模量、最大应变等的差异均无显著性意义。结论PEG法去除细胞完全,细胞外基质保存完整,对组织机械性能无明显影响,适于构建组织工程带瓣管道。关键词组织工程; 聚乙二醇; 生物带瓣管道 ;去 细胞化中图法分类号R318. 1Biophysics of Acellular Porcine Valved Conduits by Decellularization with Poly Ethylene GlycolJiang Xionggang，Xu Peng, Han Xiao et alDe partment of Cardiovascular Surgery, Union Hos pital, Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022Abstract Objective To study a new method of preparing acellular porcine valved conduits by decellularization with polyethylene glycol and to observe the change of mechanical properties. Methods The porcine aortic conduits were decellularizedwith poly ethylene glycol (PEG) and DNase I，while the fresh porcine aortic conduits were used as control. Histological ex-amination of them stained with HE dye was done. The content of DNA was detected in the two groups by photometer. The me-chanical properties were assessed by AGS-J. Results The decellularizing percentage was 95. 32 % and the structure of extracellular matrix (ECM) was well reserved in PEG group. The mechanical properties had no significant difference between thetwo groups in peak load, maximal stress, etc. Conclusion The method of PEG could remove cellular components effectively,while it did not disrupt the histological structure of ECM and the mechanical properties.Key words tissue engineering; poly ethylene glycol; porcine cardiovascular conduits; decellularization组织工程是运用工程学和生命科学的原理,构~3cm的管道组织,分为去细胞组和对照组,每组建生物替代品,用以维持、恢复和提高组织的功能。各5个管道组织。现已有多种不同的去细胞方法用来制作去细胞天然1.2去细胞组带瓣管道的制备生物支架,但是这些方法或多或少存在不足,所以寻①新鲜猪动脉带瓣管道首先置入含抗生素PBS找-种最佳的去细胞方法仍是构建组织工程生物支液(NaCl:8 g/L.KCl:0.2 g/L, KH2PO2:0.2 g/L,架的重要组成部分。本实验采用1%聚乙二醇.Naz HPO4:3.48 g/L,青霉素,链霉素各100 U/ml)(PEG)和DNase I处理猪带瓣管道组织，探讨中漂洗数次,除去血块和黏着物。②放入1 g/mlPEG法在生物带瓣管道准备中的应用价值,并比较PEG(Mw=1 000,上海浦东高南化工厂)中,室温下PEG去细胞前后带瓣管道的物理特性。浸泡30~45 min.振荡器加以振荡。③含抗生素PBS液浸中国煤化工U/ml DNase I液(Sig-材料和方法maMYH.CNMHG素PBS液浸泡24hx1.1实验材料与分组3次,置入含抗生素PBS液于4 'C 保存待用。取刚宰杀成年猪的心脏，取其动脉瓣和瓣上21.3新鲜带瓣管道的制备用含抗生素PBS反复冲洗3次后,以含抗生素蒋雄刚，男,万方数副教授PBS液浸泡30 min后置于4 'C 保存待用。华中科技大学学报(医学版)2006年10月第35卷第5期1.4组织形 态学观察测试仪,协和医院骨科力学实验室),夹持间距为10从去细胞组和对照组分别切取6块管道壁组mm。以5mm/min将瓣膜向两边拉伸,记录最大织,4%多聚甲醛固定后,苏木精伊红染色观察去细负荷、最大应力、最大应变和弹性模量。胞情况,胶原纤维和弹力纤维染色了解管道细胞外1.7 统计分析基质状况。采用SPSS 12. 0统计软件进行数据分析，数据1.5 DNA含量测定以x士s表示,样本均数比较用组间t检验，P<<从去细胞组和对照组分别随机切取6块管道壁0.05为差异有显著性意义。组织,各称重100 mg后放入深低温冰箱冻存3 h,2结果将冻存组织研磨,PBS匀浆，3 000 r/min 离心5min。加入RNA裂解液500μl和20mg/ml蛋白酶2.1组织形 态学观察K5pμl,37C水浴12h;加500μl酚氯仿异戊醇新鲜带瓣管道组织柔软,略带粉红色,去细胞组(25 : 24 : 1),10 000 r/min离心15 min;水相移入管道组织较新鲜组织略薄，呈乳白色。切片观察,对新管,加3 mol/L醋酸钠40 μl,与1 ml冷无水乙醇照组含有大量的细胞结构,包括间皮细胞、成纤维细混匀,一20 'C 静置30 min;14 000 r/min 离心20胞、内皮细胞及毛细血管等,并有网格状的胶原纤维min,弃上清;室温干燥10 min后,沉淀溶于40 μl和弹性纤维(图1A,封4)。去细胞猪带瓣管道组织TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L ED-中基本看不到细胞成分,胶原纤维排列整齐,无明显TA,pH 8. 0),分光光度计测定260 nm处吸光度断裂,仍呈波浪状平行排列,结构紧凑,弹性纤维结(A)值。去细胞率(%)=(对照组A值-去细胞组构清晰,组织无明显水肿(图1B、C.D,封4)。A值)/对照组A值X 100%。2.2 dNA 含量分析1.6 力学测试PEG处理后去细胞百分率为95.32%。去细胞组和对照组分别随机切取8块管道壁组2.3生物力 学测试结果织，管道壁组织沿长轴剪成1.5cmX0.8cm矩形条与新鲜带瓣管道组织相比，去细胞组织最大负块,夹持在两片细砂纸做成的框架中。带组织条块.荷、最大应力,弹性模量,最大应变等差异均无统计的砂纸框架两边夹于力学测试仪(AGS-J电子万能学意义(表1)。表1两组带瓣管道机械性能测试比较(z士s,n=8)分组最大负荷(N) .最大应力(N/ mm)最大应变(mm/N)弹性模量去细胞组21. 242士1.4354. 877士0.57235. 118士6. 04516.549士0.678对照组25. 586士1.6935. 974士0. 34233. 685士7.53317. 152士1.579有功能的组织”。对生物材料的处理,目前多使用3讨论去细胞方法[2]。去细胞生物材料在完全去除原有细心脏外科许多疾病的治疗涉及半月瓣及其所属胞成分的基础上,因保留完整的瓣膜细胞外基质血管的替换，临床上许多手术如Rastalli、 Ross、(ECM),使种子细胞易于黏附和生长叼,且由于主Konno、Norwoodll期手术等都需要以带瓣管道为要组织相容性抗原存在于所有有核细胞，带瓣管道材料。目前临床应用的人工带瓣管道为大口径的机去细胞处理消除了细胞表面主要组织相容性抗原和械瓣膜,不适合小儿应用,并需终生抗凝。生物带瓣细胞内的蛋白抗原,改善了组织相容性,能明显减少管道则具有较好的组织相容性和更广泛的适应证。由异种细胞引起的免疫反应所造成的瓣膜钙化和衰但异体组织免疫原性所致酶、化学降解使带瓣管道败*]故被认为是-种具有前途的组织工程生物材变性、撕裂、钙化、新生物形成,严重影响了带瓣管道料。中国煤化工组织形态学与人类相.的使用寿命。因此对异体带瓣管道进行预处理以消以[5MYH. CNMH G究。现已有多种不同除免疫原性、防止降解、增强修复和再生的能力是生的去细胞方法用来制作去细胞天然生物支架,均取物带瓣管道研究的目标。得一定的效果+10]。理想的带瓣管道应具有良好的组织工程的理想目标，是将自体活细胞种植于组织相容性和较好的物理特性,其制备的关键在于高分子材料或坐物材料等可降解支架上,最终形成去细胞程度和ECM完整性的保留。经典的Tri-蒋雄刚等.聚乙二醇去细胞化组织工程带瓣管道的物理特性tonX-100、胰酶EDTA四步法在去细胞的同时对=考文献ECM也具有一定的消化作用,其去细胞后带瓣管道的机械强度受到影响。因此寻找一种最佳的去细胞[1]叶福林,徐志云,张宝仁,等.去细胞猪主动脉瓣叶的获取和内皮细胞的种植[J].中国修复重建外科杂志,2003, 17(6):方法仍是构建组织工程生物支架的重要组成部分。本实验采用1%PEG和DNaseI处理猪带瓣管[2]LETH R G，WILHELMI M，WALLES T, et al. Acellu-larized porcine heart valve scaffolds for heart valve tissue en-道组织，结果显示经PEG处理后的带瓣管道组织gineering and the risk of cross spices transmission of porcine中几乎所有细胞成分均被去除,去细胞百分率达到endogenous retrovirus[J]. J Thorac Cardiovase Surg, 2003,126(3): 1000- 1004.95.32%,且组织形态学观察,处理后的胶原纤维、弹[3]HODDEJ P, RECORDR D, TULLIUSRS, et al. Reten-tion of endothelial cell adherence toporcine- derived extracellu-力纤维仍保存清晰的层状结构,无明显断裂、空洞、lar matrixafter dsisnfection and sterilization[J]. Tissue Eng,或组织水肿,支架的空间结构完整保存。猪主动脉[4]2002,8 (2): 225-234.SIMON A, WILHELMI M, STEINHOFF G, et al. Cardiace中主要含有II、II型胶原和部分弹力纤维,其力学特valve endothelial cells: relevance in the long term function of性主要由这些成分决定。最大限度保存ECM成分biologic valve prostheses[J]. J Thorac Cardiovasc Surg，1998, 116(4); 609-614.对维持生物支架固有的力学强度具有重大意义。本[5]叶福林.徐志云,张宝仁,等.猪主动脉组织工程瓣膜制备的初步研究[J].第二军医大学学报,2003 ,24(3): 242-244.实验力学测试表明去细胞处理后的最大负荷和最大[6]CURTIL A. PEGG DE, WILSON A. Freeze drying of car应力和新鲜组织无明显差异,表明此法将猪主动脉diac valves in preparation for cellular repopulation[J]. Cryo-biology, 1997, 34(1): 13-22.去细胞后所获得的纤维支架可以满足组织工程支架[7]LIVESEY s, BOERBOOM L, COLEMAN C. Dellularized的强度要求。porcine heart valves as templates for host cell repopulation[M]. Georgia:Georgia Institue of Technology, 1998.PEG法去细胞成分彻底,而对猪主动脉组织结[8]BADER A. HERDEN T, GIERE B, et al. Tissue engineer-ing of autologous heart valves using a physiologic matrix构和力学性能无明显影响。与常用的TritonX-structure[J]. EurJ Cell Biol, 1997, 74(1): 8-15.100、胰酶EDTA四步法相比，使用试剂少,操作简[9]BADER A, SCHILLING T, TEEBKENOE, et al. Tissueengineering of heart valves- human endothelial cell seeding of化,去细胞过程更加方便、有效。用此法去细胞处理detergent acellularized porcine valves[J]. Eur J Cardiothorac后的猪主动脉组织机械性能保持不变,组织结构无[10] RIEDER E, KASIMIR M T, SILBERHUMERG, etal. DeSurg，1998， 14(2): 279-284.明显破坏.完整的细胞外基质提供了细胞黏附生长cellularization protocols of porcine heart valves differ impor-的正常结构和生理环境,为受体细胞化组织工程瓣tantly in efficiency of cell removal and susceptibility of thematrix to recellularization with human vascular cells[J]. J膜的研制提供了可靠的天然支架材料。Thorac Cardiovasc Surg, 2004, 127(3): 399-405. .(2006-02-20收稿)(.上接第658页)内皮源性NO以拮抗低氧引起的缩血管反应,另-dentification by morphologic and immunologic criteria[J]. JClin Invest, 1973. 52(9): 2745-2756.方面血管内皮细胞表现出ICAM-1高表达的表型,[2] TANUS SANTOSJ E, MORENO H. Is there a place for in-加剧了血小板的黏附与聚集,进而导致血管收缩因haled nitric oxide in the therapy of massive pulmonary embol-ism ?[J]. Anesthesiology, 2001, 94 (2): 354.子和舒张因子平衡的失调,使得白细胞及血小板黏[3] TRUMMER G, BERCHT0LD HERZ M, MARTINJ, etal.附、血栓形成、平滑肌细胞异常增生并向内膜迁移,Successful treatment of pulmonary hypertension with inhalednitric oxide after pulmonary embolectomy[ J ]. Ann Thorac进一步加剧了肺血管的缺血低氧。本研究结果提示在低氧状态下NO与ICAM-1[4] WAKEFIELDT w, STRIETER R M, WILKEC A.et al.Venous thrombosis associated inflammation and attenuation均有-定水平的上升,推测在低氧性肺血管疾病中,with neutralizing antibodies to cytokines and adhesion mole-cules[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1995, 15(2):258-NO与ICAM-1作为生理介质发挥了重要的的调控作用,进-步的研究将有助于血栓性疾病的防治。5]中国煤化工al. Reduced neointima hyper-terellular adhesion molecule-YHC N M H Goo, 86(4):434-440.参.考文献[6] TORBICKI A，VAN BEEK EJ R. CHARBONNIER B, etal. Guidelines on diagnosis and management of acute pulmona-[1] JAFFEE A, N ACHMAN R L, BECHERCG, et al. Cul-ry embolism[J]. Eur Heart J,2000,21(16):1301-1336.ture of human endothelial cells derived from umbilical vein. I-(2005-11-25收稿>聚乙二醇去细胞化组织工程带瓣管道的物理特性[正文见第659页]A:对照组苏木精伊红染色;B:去细胞组苏木精-伊红染色:C:去细胞组胶原纤维染色:D:去细胞组弹力纤维染色图1猪动脉带瓣管道组织形态学观察( X 100)华中科技大学学报主管单位中华 人民共和国教育部Superised by Ministry of Education.主办单位华中科技大学Pcople's Republic of China(医学版)编辑出版华中科技大学同济医学院Sponsored by Huazhong UniversityActa Med Univ Sci学报编辑部of Science and TechnologyEdited by Ediorial Department ofTechnol Huazhong(430030武汉航空路13号)Tongi Medical College of HUST日刷长江水利委 员会航测信息双月刊Bimonthly(13 Hangkong Road. Wuhan工程院印刷厂430030)名誉主编裘法祖国内发行武汉 市邮局SuberiptionHonorary Chief Editor Qiu Fazu订购处全国各地部局Domestic: Post Offices of Dif-主编田玉科国外发行中国国际图 书贸易总公司ferent Levels in ChinaChief Editor Tian Yuke(北京399信箱)Foreign: China lntenaional Book发行范围公开发行TradingCorp. P. 0. Box2006年第35卷第5期广告经营许可证号武工商广字399. Beijing, China2006年10月出版4201004000670号E mail: tjxb@ mails. tjmu. edu. cnOet. 2006 Vol. 35 No. 5刊号: ISSN 1672-0741 CODEN中国煤化工1957年3月创刊CN 42-1678/R国内代号:38-37国外代号:BM198国内定价MHCNMHG