聚乳酸-聚乙二醇的制备及骨修复实验研究

现代口腔医学杂志2006年第20卷第5期J Modern Somatol ,September 2006 ,Vol 20 ,No. 5501.聚乳酸一聚乙二醇的制备 及骨修复实验研究孔航潘可风吴志刚[摘要]目的研究聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)共聚物作为细胞因子骨形态发生蛋白(BMP)碱性成纤维细胞生长因子( bFGF的载体修复下颌骨缺损的效果。方法制备多孔 PLA- PEG共聚物并对其进行表征。将PLA- PEG/BMR(实验组1 ) PLA- PEG/BMP/bFGR实验组2和PLA- PEQ(对照组)分别植入27只雄性新西兰白兔的下颌体部骨缺损处。术后2周、4周和8周对实验标本的成骨状况进行大体、X线、组织学、扫描电子显微镜观察及计算机图像分析。结果实验 期间各组成骨活跃。2 周时实验组2成骨量最多实验组1其次对照组最少差异在统计学上有显著性意义( P <0.05);4周时实验组2成骨量最多其余两组成骨量差异不大( P>0.05 )8周时各组的成骨量的差异在统计学上无显著性意义( P >0.05)结论新型的 PLA- PEG共聚物呈现良好的生物相容性和骨引导性是BMP和bFGF的良好载体。[关键词]聚乳酸细胞因子下颌骨缺损The study of the copolymer of PLA and PEG on the repair of rabbit mandibular defect KONG Hang ,PAN Kefeng ,WU Zhigang. School of Material Science and Engineering , Tongji Unirersity , Shanghai 200092[ Abstract] Objective To evaluate the effect of the new PLA - PEG and the composite of PLA - PEG , bonemorphogenetic protein( BMP ) and basic fibroblast growth factor( bFGF ) on the regeneration of the rabbit mandibulardefects. Methods The porous PLA- PEG was prepared by ring - opening polymerization and solvent - casting/ particle. leaching. PLA - PEG( control group), PLA - PEG/BMP ( experimental group A ) and PLA - PEG/BMP/bFGF( experimental group B ) were respectively implanted into 27 rabbit mandibular defects. Two , four and eight weeks afteroperation, the rabbits were sacrificed and the specimens examined by naked eyes , X - ray ，optical microscope ,computerized image analysis and SEM. Results At the 2d week the regenerated bone in the experimental group B wassignificantly more than that in the experimental group A , trailed by control group. At the 4"h week the new bone in theexperimental groupB was more in size , no statistically significant difference of the new bone between the other twogroups. At the 8th week there was no statistically significant difference among the three groups with regard to the boneregeneration. Conclusion This new PLA - PEG possesses sound biocompatibility and osteoconductivity , which will havemore positive effect on bone regeneration when combined with BMP. And bFGF can synergistically enhance the boneregeneration with PLA - PEG and BMP. This new biomaterial is safe and reliable in bone regeneration. .[Key words] Polylactic acidCytokineMandibular defect中图分类号:R782.2文献标识码:A迄今为止人们已经对多种骨组织缺损修复与材料和方法重建材料进行了大量的研究1-61。其中聚乳酸( PLA )材料成为最活跃的研究领域。1.实验材料及设备:丙交酯(D,L- LAX同济本研究在PLA中引入聚乙二醇( PEG)并将这大学材料学院自制);PEG(中国医药集团上海化学.种新型的PLA- PEG材料分别与骨形态发生蛋白试剂公司化学纯);骨形态发生蛋白(BMP)100mg,( BMP和碱性成纤维细胞生长因孔( bFGF )相复合,粉剂中国煤化工!供);碱性成纤维细胞观察其对兔下颌骨缺损修复的作用。生长MHCN M H G液双组份(北京双鹭药业生产)动物手术器械;X线牙片机光学显微镜;高清晰度彩色病理图文计算机分析系统Motic上海市科委重大项目基金资助课题(编号05D]14006 )作者单位200092上海同济大学材料科学与工程学院(孔航、Images Advanced 3. 0(上海医科大学病理科提供)昊志风)同沥发销数擒医学院潘可风为通讯作者)2.多孔PLA-PEG的制备:采用两步法制备,502.现代口腔医学杂志2006年第20卷第5期J Modern Somatol Setember 2006 ,NVol 20 ,No.5即先由乳酸缩聚制得丙交酯(见反应方程式1 ),再况完整取出下颌骨观察下颌骨标本上材料植入区用丙交酯与聚乙二醇聚合制得PLA- PEG共聚物骨组织愈合情况。将下颌骨从颏正中联合处分离断(见反应方程式2)其中LA与PEG的聚合比例为开进行X线摄片观察。10:1 PEG的数均分子量为6000。(见反应方程式7.脱钙骨组织标本HE染色:将下颌体的骨缺1、2 )然后利用溶剂浇铸-颗粒滤沥技术制备三维多损区对照组和实验组的植入材料部位的周缘缘外孔支架78。用打孔机制备成直径为5mm、高为1mm处锯下，并从中间矢状剖开显露骨愈合界面,3mm圆柱形多孔支架材料钴60照射灭菌。10%福尔马林固定,脱钙,石蜡包埋,切片,HE染色光镜观察。OHn CHsCHCOOHCatalyst，HIC8.标本的超微结构观察:标本从中间切开显露-H2OCH:骨愈合界面2%戊二醛中固定扫描电镜观察。9.计算机图像分析:每个脱钙HE染色切片上反应方程式1乳酸缩合制备丙交酯距正常骨壁0.5mm处随机取-圆形视野区域通过图像分析软件分析目标区(新骨形成区域)占所选中H0一PEG - -0H+1/2mr区域的面积百分比。10.数据处理和统计学分析:使用Excel软件和Hs- +OCHC+ +(OCH-CHx 0- +CCHO)SAS6.12软件对成骨面积的百分比数据进行方差。分析，以P <0.05为差异有显著性意义。各组数据反应方程式2丙交酯与聚乙二醇聚合制得PLA- PEG共聚物.均进行正态性检验。3.多孔PLA- PEG材料的性能表征:采用结果Waters-150C型凝胶渗透色谱仪测试共聚物的分子量;使用HITACHI公司S- 2360N扫描电子显微1.材料的性能表征本实验结果证明采取常规镜观察多孔支架的超微结构;采用比重瓶法测定材的有机高分子聚合方法获得的PLA- PEG聚合物料的空隙率材料置于0.2M的磷酸缓冲溶液( PBS )平均分子量约35973道尔顿。对PLA- PEG多孔中(pH=7.4 ,37C )进行体外降解,降解时间共22薄膜用扫描电子显微镜进行表面形貌观察,支架为周。互穿多孔结构孔分布均匀孔径约为120 ~ 200pum4.动物模型的建立选取健康雄性新西兰白兔(图1》孔隙率测定显示材料孔隙率约为84.7%。27只,体重2~3kg随机分为3组每组9只。3%戊巴比妥钠按体重1ml/kg的剂量经兔耳缘静脉注射行全身麻醉。于下颌骨下缘上3mm处平行于下颌骨下缘逐层切开,于近下颌骨下缘下颌骨体处用电机慢速档(1000~2000rpm)去除皮质骨和部分松质骨制备成直径5mm深3mm的缺损。对照组将PLA- PEG置入骨缺损内实验组1 :在 PLA- PEGA100 e000 ISKV 500 Ls材料中滴入含有5mgBMP的生理盐水溶液0.1ml,待材料充分吸收该溶液后将PLA- PEG/BMP置图1样品表面形 态的超微结构入骨缺损中实验组2在PLA- PEG材料中滴入含2.材料体外降解实验该材料的吸水率较高在有5mgBMP和100u的bFGF的生理盐水溶液前10周吸水率逐步增加,10周左右的时间吸水率0.1ml然后按照实验组1的方法进行操作缝合手达到|YH中国煤化工(表1)多孔支架的术创口。每组植入物高度均与下颌骨体表表面平重均CNMH G剧下降的过程(表1)齐。术后肌注庆大霉素8万uo随着降解时间的延长,样品的重量在逐渐减少(表.5.实验动物标本的观察时间及处理:术后第2、1》pH值随着降解时间的延长而逐渐降低(表1)4、8周分批处死每组3只动物完整取出下颌骨。多孔材料至6周时急剧膨胀到第10周时尺寸不再6.大体观察及X线摄片:观察该区域软组织情变大在第14周时尺寸出现缩小随后开始崩解变.现代口腔医学杂志2006年第20卷第5期J Modern Somatol ,September 2006 ,Vol 20 ,No. 5503.成微小的碎片颗粒状物质。面和材料的孔隙中同时有毛细血管长入材料孔隙表1 PLA- PEG体外降解实验不同时间各项指标的变化实验组2新生骨量最多对照组最少。4周时，对照检测指标实验时间组与实验组1可见类骨样物质融合呈片状分布两1周2周4周6周10周14周18周 22者面积相差不明显其中可见钙化结节(图2A箭头吸水率10%)0 2.21 2.8 6.8 8.77 13.99 13.88 10.64 7.85失重率10%0 )00 93.892.487.383.766.756.251.948.所示) ,但实验组1钙化结节面积大于对照组(图2B分子量(Dlum) 46046 NVA 41638 34704 26492 17970 13496 10684 6918箭头所示》实验组2可见大片状类骨样物质生成,pH值.4 7.35 7.3 7.26 7.1 6.89_ 6.91 6.88 6.8面积大于对照组和实验组1新生骨较2周时成熟，3.骨组织标本大体观察:各组骨缺损创口愈合可见较多钙化结节(图2C所示)材料占据面积较良好未见明显的炎症反应。各组新骨生成量均随减少,且呈散在分布。8周时各组新生骨的成熟性着时间的推移而增加材料逐步降解。第2周时实较以前高,钙化结节数量及范围较前增加材料占据验组2成骨量最多实验组1次之对照组最少。第区面积进一步减少，且呈散在分布。随着时间的推4周时实验组2成骨量最多实验组1和对照组基移镜下可见类骨样物质及钙化结节增多细胞成分本相同。至第8周时,各组缺损已完全为骨组织覆减少。盖,但是其强度仍稍低于正常骨组织各组材料至此6.电镜观察结果植入2周时各组可见骨和材时仅剩余少量颗粒于缺损中央部位。料碎片的界面处有胶原纤维存在材料结构致密断4.x线观察:各组样本均随时间的推移，对X面高低不平部分碎片表面有孔状结构。植入4周线阻射增加。第2周时各组均可见阻射影实验组时图3A、B.C) ,各组可见材料碎片胶原纤维(图2密度最大实验组1次之，对照组密度最小。第43A箭头所示)增多部分材料表面见微孔,孔径约6周时对照组密度最低实验组1稍高实验组2密- 10ym左右(图3B箭头所示)可见细胞样结构(图度最高。至第8周时，各组缺损内部密度已接近正3C箭头所示)植入8周时,各组可见材料碎片散常骨组织，骨小梁无规则排列。在周围有少量胶原纤维和成骨细胞材料碎片的孔5.组织切片观察2周时各组均见成骨实验状结构直径约100 ~ 400pxmo .组1、2可见新生骨基质及细胞散布在材料与骨的界C图24周时对照组(A)实验组1(B和实验组xC)组织切片(x10)中国煤化工CNMHG图34周时对照组(A)实验组1(B)实验组xC)扫描电镜图像7.数据测量及统计学分析材料植入2周时实验组2和实验组1的骨生长速度在统计学上无显著504●现代口腔医学杂志2006年第20卷第5期J Modern Somatol Setember 2006 ,NVol 20 ,No.5性差异但较对照组快统计学上有显著性差异。4样物质形成和促进新骨成熟的作用。添加bFGF周时实验组2与对照组和实验组1 在统计学上有组光镜和扫描电镜观察显示缺损内成骨活跃毛细显著性差异;但对照组和实验组1两者骨修复情况血管增殖明显8周时骨成熟性高,且新生血管增生统计学上无显著性差异。8周时,三组生长速度统活跃。通过实验数据的统计分析,可以看出在2、4计学.上无显著性差异(表2 )周时新生骨的成骨量较其它两组有显著性增加。这表2各组在不同时间新骨生成面积比例 单位x+ S)些结果提示成纤维细胞生长因子在和PLA- PEG术后观察时间以及BMP复合后发挥了促进毛细血管增殖的效实验材料分组2周( 100% )4周( 10%) 8 周( 100%)应在协同作用下加速了缺损的修复。PLA- PEG组0.175+0.054 0. 426+0.0930.655 +0.024但是在标本的大体观察中8周时缺损的中央PLA- PCG+ RMP组0. 290+0.0450.384+0.0540. 589 +0.059PLA+ BMP+ bFGF组0.47640.075 0.636+0.046 0. 682 t0.160位置仍可见材料占据因此此种材料在体内实验中2周时各材料组间比较F =52.82,P =0.0001 4周时各材料组间比的降解性稍差需做进-步调整。较F=32.04,p=0.00018周时各材料组间比较F=1 86PL A- PEG组内各时间段比较F=114. 57.p=0 0001:PLA-PEG+BMP组内名时间限比最时间段比较=0.001:P[ A_ PEG+'bFGF组内.0000001 ;PLA- PEG各时间段比较F =8.41 ,P =0.0021。1 Andrea Bagno , Carlo Di Bello. Surface treatments and roughness讨论propertiesof Ti - based biomaterials. J Mater Sci Mater Med ,聚乳酸PLA )是近年来作为组织工程支架的可2004 , 159)935 - 949.Kokubo T , Kim HM , Kawashita M, et al. Bioactive metals :吸收材料之一。但其可能导致炎症反应9,10]，缺乏preparation and properties. J Mater Sci Mater Med ,2004 ,152):反应性官能基团亲水性较差。PEG 因其分子链的99- 107.柔顺性特有的细胞亲和性以及可降低蛋白质免疫3 Ohgushi H , Miyake J , Tateishi T. Mesenchymal stem cells and性的特点被本次研究用于对聚乳酸进行化学改性。bioceramics : strategies to regenerate the skeleton. Novartis Found .骨缺损修复材料乃至体外组织工程的支架材料Symp , 2003 ,249 :118- 127.4 Katti KS. Biomaterials in total joint replacement . Colloids Surf B需要具有-定的孔隙率和孔径,以容纳细胞和细胞Biointerfaces , 2004 , 39(3):133- 142.因子并促进其功能的发挥。目前有多种PLA三维Garvin K，Feschuk C. Polylactide-polyglyoolide antibiotic结构制备方法11.12。其中溶剂浇铸-颗粒滤沥技implants. Clin Orthop Relat Res , 2005 ,( 437 )105 - 110.术可以通过控制微粒的粒径和混入量来控制支架的， Wiesmann HP , Meyer U, Plate U ,et al. Aspects of cllagen孔径和孔隙率。因此我们选择该技术来制备PLAmineralization in hard tissue formation. Int Rev Cytol ,2004 ,242 :121- 156 .- PEG中合成的孔隙率84.7%左右孔径为150 ~李世普.生物医用材料导论.武汉武汉工业大学出版社2000 :250μm分子量为35973道尔顿理论上符合支架材186 - 188.料的要求。3 任杰吴志刚. PLA- PEG共聚物三维多孔支架的制备及表征.对照组(PLA-PEG)在光学显微镜下显示成骨材料导报2004 ,18(3)93-95.是由材料和骨的界面处向内部随时间的增加而增加) lizuka T , Mikkonen P ,Paukku P ,et al. Reconstruction of orbital的。新生骨基质、新生血管和成骨细胞清晰可见提floor with polydioxanone plate. Int J Oral Maxillofac Surg , 1991 ,20(2)83 - 87.示成骨比较活跃。而且在8周时较其它两组新生骨10 Bos RR ,Roema FR ,BoeringG ,et al. Bone - plates and screws面积并无明显差别,提 示这种材料具有良好的骨引of bioabsorbable poly(L- lactide)-- an animal pilot study. Br.导作用。光镜下观察没有发现材料周围纤维包裹Oral Maxillofac Surg ,1989 , 2X( 6 )467- 476.现象和炎症细胞浸润提示这种材料的生物相容性11 Nam YS, Yoon JJ，Park TG. A novel fabrication method of较好。从数据统计分析来看对照组随着时间的增macroporous biodegradable polymer scaffolds using gas foaming salt加新生骨的成骨量有显著性的增加提示这种材料中国煤化工ler Red Appl Bionater )20000 '在通过骨引导作用促进骨缺损的愈合方面的效应是12fHCNM HGbehaviors of biodegradable持久的。macroporous scaffolds prepared by gas foaming of effervescent添加BMP的两实验组光学显微镜下可见局灶salts. J Biomed Mater Res 2001 55 3 )401 - 408性成骨在骨缺损的各部位散在分布。统计结果显示(本文编辑王植三) (收稿日期2005 -08 - 15)(修回日期2005-11-28)较单纯P反方数握G组在2、4周时有明显促进新骨