新型聚乙二醇接枝聚乳酸及其降解特性研究

高技术通讯2007年7月 第17卷第7期新型聚乙二醇接枝聚乳酸及其降解特性研究T赵明媚②潘君③吴杨兰刘颖李永刚王远亮(重庆大学生物工程学院重庆 4004)滴要通过直接酰胺化反应,以马来酸酐本体改性聚乳酸(MPLA)和氨基封端聚乙二醇(H2N-PEG-NH2)为原料,合成了聚乙二醇本体改性聚乳酸(PPLA)。通过红外、核磁共振技术对改性聚合物的结构进行了表征;采用FTC标记牛血清白蛋白(FTTC-BSA)为模型蛋白质,测试了聚合物对蛋白质的非特异性吸附;利用吸水率表征了聚合物的亲水性;利用聚合物在12周降解过程中pH值、失重率的变化评价了它们的降解特性。结果表明:HN-PEG-NH2已成功接枝到MPLA上;与聚乳酸(PLA)、MPLA相比,PPLA明显降低了对FTTC-BSA的吸附;其亲水性和降解性增加。预计该材料将是一种更适合组织工程和药物缓释应用的聚乳酸类可降解材料。关键词聚乙二醇, 聚乳酸，接枝,亲水性,降解性循环时间也增加[5)。聚乳酸与PEG的三嵌段共聚0引言物( PLA-PEG-PLA)可提高材料的亲水性降解速率聚乳酸(PLA)是研究最早的聚酯类生物可降解和生物相容性[16]。材料之一。早在1966年, Kulkarmi等[1]就指出PLA本实验室1[7,18]采用马来酸酐(MA)、乙二胺对在体内降解生成的最终产物是CO2和H20,其中间PLA进行了本体接枝改性,在PLA侧链上引入了羧代谢产物乳酸是体内正常代谢产物,不会在体内蓄基和氨基,维持了聚乳酸的主链结构，亲水性明显增积,在药物控释体系[2]和组织再生3]等方面已有大加,降解过程不出现pH值陡降现象。本研究在此量应用。基础上,通过聚乙二醇( PEG)对PLA进行本体接枝研究显示,亲水性的表面有利于细胞黏附生改性,旨在维持降低PLA对蛋白质的非特异性吸长[4.5) ,材料的亲水性好,对细胞的亲和性则好[6.7]。附，提高其亲水性,从而提高它在药物缓释及组织工在药物缓释领域,需要药物载体在血液中有足够的程中的应用性能。经文献检索,采用本体接枝的方停留时间，以充分地释放和利用药物[8]。而在靶向法引人PEG的研究未见报道。药物缓释中,需要几个基本的条件才能实现,其中就1实验部分包括降低非特异性的相互作用[9]。随着组织工程的发展,需要支架通过特异性的受体介导支架材料和1.1材料的制备细胞之间的相互作用,以调节细胞的生长,而要实现马来酸酐接枝聚乳酸(MPLA):根据文献[14]自.这种调节作用,首先就需要控制细胞和支架材料间制，马来酸酐的接枝率为2.36% , Mw = 44960。分别的非特异性相互作用10.1]。由于PLA亲水性差,缺取1.000g MPLA和0. 587g氨基封端聚乙二醇(H2N-少抗非特异性蛋白吸附的能力,导致其对细胞的黏PEG-NH2 ,Sigma, Mw = 600)用四氢呋喃溶解(THF:重附力弱,也导致其微球在体内的循环时间短[12]。庆试剂公司,分析纯)溶解。将HN-PEG-NH2溶液研究表明,聚乳酸与聚乙二醇(PEG)的两嵌段置圆底烧瓶中,水浴50~ 55C搅拌条件将MPLA溶共聚物(PLA-PEG)可以提高材料的亲水性、降解速液滴加到圆底烧瓶中。滴加完毕后保温2h,反应产率及药物在材料内的分布情况[13] ,延长其微球的在物通过THF-水体系纯化,提纯直至溶液中无H2N-体循环时间[4);随着表面PEG浓度的增加，其在体PEG-中国煤化工上分析,-般进行3YHCNMHG0国家自然科学基金300084)和国家“111 计划一生 物力学与组织修复工程"资助项目。女,1978年生,硕士;研究方向:生物材料; E-mail: chaoningmei@ 163. com河作E:iligaorj@ cqu. edu.cn- 736.. -赵明媚等:新型聚乙二醇接枝聚乳酸及其降解特性研究遍。收集沉淀,将沉淀物在室温下真空干燥48h,得重率% weight loss,计算公式为:到H2N-PEG-NH2本体改性聚乳酸(PPLA)产品。% weight loss =W1- W2x 100%1.2 仪器与方法W1- Wo .1.2.1 红外光谱以THF为溶剂,在KBr晶体上通过溶剂挥发铸2结果与讨论膜法制膜,用红外光谱仪( Perkin- Elmer Spectrum GX2.1 红外谱图与解析model)记录聚合物在400 ~ 400em的吸收光谱。图1给出了PPLA 的合成机理。如图1所示，H2N-PEG-NH2通过与MPLA发生N-酰化反应,生成1.2.2核磁共振谱以氘代氯仿(CDC])为溶剂,四甲基硅烷(TMS).了PPLA。 图2给出了MPLA与PPLA的红外图谱。为内标,用核磁共振波谱仪( Bruker AV 400 0 model )从中看出,与MPLA的红外图谱相比, PPLA在测定PPLA的'H-NMR谱图。.1634cm~'和1577cm~l出现了酰胺键的特征-N-H-弯1.2.3 FITC标记牛血清白蛋白(FTC-BSA)在聚合曲振动吸收新峰,3100 ~ 3700 cm-1的峰比MPLA的物材料表面的非特异性吸附强度大大提高,这是PPLA中-0H、-NH2 -CONH伸缩分别称取0. 1g PPLA、MPLA和PLA,用5mL THF振动峰重叠的结果。图2结果显示，MPLA经反应.溶解,在直径为9cm的培养皿内通过溶剂挥发48h后已经生成PPLA。.成膜，室温真空干燥至恒重。将10mL、浓度为0.02mg/mL的FTC BSA(Sigma)水溶液加入含聚合物膜的培养皿中,379C静态孵育30min,倒掉上清液,CHOH用蒸馏水洗去未吸附的FITC BSA,通过荧光分光光CHsCH3度计检测,直至水洗液中检测不到荧光为止。在倒置荧光显微镜(Olympus IX-71)下，以蓝色光激发,观MPLA测材料表面的荧光并照相。HN-PEG-NH21.2.4吸水率的测定分别称取0.2g MPLA和PPLA,用5mL THF溶0、.p解,加入直径为10cm, 质量为Wo的培养皿中,通过H溶剂挥发48h成膜,室温真空干燥至恒重。加入pH=7.4的PBS缓冲溶液,在(37.0+0.5)C下浸泡」024h。用滤纸吸干表面的水,用电子天平(METLER-0H HNAE100)称重,精确至0.1 mg,记为W,再真空干燥至PEG恒重,称重,记为W2。实验重复3次,计算得到吸水H2N'率为Ra=W,- W2PPLaw2-w。图1 PPLA 合成反应的反应机理(以H2N-1.2.5 降解过程中pH值和失重率的测定PEG-NH2和MPLA为原料)分别称取0.1g MPLA和PPLA,用2mL THF溶解,加入内径2cm,高2cm,质量为Wo的培养皿中,每个聚合物制备了36份样品，通过溶剂挥发48h成膜,室温真空干燥至恒重,并用电子天平称其重量，精确至0.1 mg,记为W: ;在培养皿内加入2mL 0.1MwPPLA的PBS(pH= 7. 4)缓冲溶液,盖封,置于(37.0土0.5)C孵箱(WGP-300型隔水式电热恒温培养箱)中国煤化工中,每周分别取出含MPLA和PPLA的3个样品,用[HCNMHPHS-3C型精密pH计测量其上清液的pH值。吸走4000” 30Uuz001500上清液,然后在真空干燥箱内,室温干燥至恒重,用图2 MPLA 与PPLA的红外图谱电子天平称其重量,精确至0.1 mg,记为W2,计算失一737-高技术通讯2007年7月 第17卷第7期a~oHt CHCH |-nHC- HiCo=F =0OH NHNH2CH.CHCH2(OCH2CH)mOCH2CHCH3自eddeab(l(d(1):全谱(0~ 8 pm); (I):放大图谱(1 ~2 ppm)图3 PPLA的核磁共振氢谱及归属2.2核磁共振谱图与解析图4吸附在PPLA(a), MPLA(b)和PLA(c)表面的FTTC如图3所示,a处是PPLA中H2N-PEG-NH2 残基BSA,在倒置荧光显微镜(Olympus IX-71)下,通过蓝色链端两甲基的吸收,d处是PPLA中H2N-PEG-NH2上光激发得到的荧光相片残基与氧相连的亚甲基的吸收,e处是PPLA中H2N-2.4吸水率测定试验解析PEG-NH2残基上链端次甲基的吸收。其它峰的归属吸水率常被用于评价材料的亲水性。本实验为:b处大的多重峰是原PLA侧链甲基的吸收,c处室[17]做过PLA与MPLA的亲水性比较,结果表明是与接枝了马来酸酐残基的季碳连接的甲基的吸MPLA比PLA有更好的亲水性。由图5可以看出,收,f的多重峰是原PLA主链上次甲基的吸收。通I0 「过图谱上归属及积分数据,可计算得到PPLA中35 t30 tH2N-PEG-NH2的接枝率为1.5%。2.3非特异性吸附试验解析图4给出了PPLA、MPLA及PLA表面吸附的15FITCBSA通过蓝色光激发得到的荧光相片。从图4可以看出,PPLA膜表面基本没有FTC-BSA的吸附,中国煤化工而MPLA、PLA膜表面则有大量FTIC-BSA的吸附,这MYHCNMHGrrlAPPLA说明PPLA明显降低了FITC-BSA 的吸附。材料图5 MPLA 与PPLA的吸水率--738.赵明媚等:新型聚乙二醇接枝聚乳酸及其降解特性研究MPLA的吸水率为16. 97%，PPLA的吸水率为周,而后者从第7周到第10周。这是因为H2N-31.2%,是MPLA的1.84倍,说明PPLA比MPLA、PEG-NH2为亲水性侧链,它增加了分子的吸水性,从PLA的亲水性增强。而加速水解。而HN-PEG-NH2为弱碱性物质,在降2.5降解过程 pH值和失重率变化试验解析解初期,酯水解产生的-CO0H部分电离形成的H+PLA类生物可降解材料的降解主要是通过水解被碱性氨基中和;但是随着降解的速度加快，大量实现的,其降解过程可分为4个阶段,即水化、初期-C00H未能被及时中和。因此PPLA比MPLA提前降解、深度降解和溶解[19]。进入加速降解阶段(图6中PPLA从第5周至第72.5.1 pH 值变化解析周)。在第一阶段,水通过亲水基团或者其它分子间2.5.2失 重率变化解析作用力靠近PLA。在这一阶段, PLA的化学结构并图7显示,MPLA、PPLA的失重率变化都包括逐不发生变化,只是PLA链松弛,其玻璃化变移温度渐增加阶段和快速增加阶段,而PPLA还多了一个降低,故在这一阶段, PLA的pH值基本不变(通常为基本不变阶段(从第10 周到第12周)。这是因为2天左右)。接着,PLA的水化区开始发生酯的水解pH值下降之后才会出现酸致自催化加速现象,因作用,链发生断裂,释放出端-C0OH和端-0H,这时此,酸致自催化加速现象应滞后于pH下降,酸致自pH值开始下降,但由于水化区有限，水解部位不多，催化所引起的失重也应滞后于pH值下降。所以，导致释放出的-C00H也不多,故pH值下降缓慢,这.对于PPLA来说,第10周开始时溶液中的酸性物质就对应着图6中MPLA的第1周到第7周。但随着基本达到饱和,导致PPLA材料链断裂生成的低聚物未能溶于溶液,而MPLA溶液中的酸性物质还没达到饱和,也就没有出现失重率基本不变阶段。+ PPLA+MPLA11000 t+PPLA世MPLA J012345678910111213降解时间(周)图6 MPLA 与PPLA的pH值随降解时间的变化曲线水化部位的增多,酯水解的部位也在增多,且随着降图7 MPLA 及PPLA的失重率随降解时间的变化曲线解体系中H+浓度的增大,酸催化的酯水解速率也在增大,释放出的-CO0H也更多。这两种效应共同本实验室采用相同的MPLA为原料,以乙二胺导致MPLA降解过程出现了pH值陡降这- -过程(图对MPLA进行了改性研究[8] ,并对PLA、MPLA和乙6中MPLA的第7周到第10周)。从图6中MPLA的降解情况可以看出,当降解体系的pH值降至二胺改性材料的亲水性[17]和降解性过程pH值变化6.44时就开始出现加速降解现象。由于这一阶段进行研究[8]。结果表明乙二胺的接枝率为马来酸与水化部位的增多和酸致自催化加速有关,所以凡酐的100% , MPLA的亲水性大于PLA, pH陡降时间是有助于水化和酸性增大的因素都可以提前和加速比PLA提前了1周左右,而乙二胺改性材料在12周MPLA的降解。亲水性提高有助于聚合物的水化。的降解过程中,pH值没有出现陡降现象。分析图6显示，MPLA、PPLA的pH值变化均呈倒sPPLA降解时pH值的变化与它不同的原因可能是:47眩的辛水性强, 接枝到形,但在相同的时间点,除了第1、2周PPLA的pHMPL中国煤化工的亲水性、降解性;值高于MPLA外,其他时间点都低于MPLA。二者(2)HYHCNMH G性弱,接枝率比它pH值差异最大时达4(第7周时，MPLA的pH值为6.4,PPLA的pH值为2.28);且PPLA的pH值陡降小,以至它没有足够的容量吸收材料降解产生的时间比MPLA提前了2周左右,前者从第5周到第7H*,导致降解过程中PPLA材料的pH值出现陡降高技术通讯2007年7月 第17卷第7期现象,该现象可通过提高H2N-PEG-NH2的接枝率来81-92克服。研究表明,由于聚乳酸的降解造成了一个酸[ 8] Gref R, Minamitake Y, Perchia M T, et al. Biodegradable性的环境,这个环境对多肽、蛋白质及DNA都是非long-circulation polymetic nanospheres. Science, 1994, 263:1600-1603常不利的[20),因此可快速降解的生物材料受到人[9] Petrak K. Essential properties of dnug- targeting delivry sys-们的关注[21]。PPLA 就具有了这个性质。tems. Drug discorery loday, 2005, 10: 1667-1673[10] Grifth L G. Polymeric biomaterials. Acta mater, 2000, 48:3结论263-277[1] Langer R, Trell D A. Designing material for biological and以马来酸酐接枝聚乳酸(MPLA)和氨基封端的medicine. Nature, 2004, 428: 487-492聚乙二醇( H2N-PEG-NH2)为原料,通过在溶剂中的[12] Ishaug S L, Crane C M, Gurlek A, et al. Ectopic bone for-酰胺化反应,成功地将PEG接枝到MPLA上,接枝率mation by marrow stromal osteoblast transplantation using poly为1.5%。吸水率为31.2% ,是MPLA的1.84倍,产(DL-lactic-C0-glycolic acid ) foamns implanted into the rat物的亲水性能比PLA明显提高;降解速率比MPLA、mesentery. J Biomed Mater Res, 1997, 36(1):1-8PLA提高,从第6周起就开始加速降解,直至12周，[13] Park S J, Kim S H, Preparation and characterization ofbiodegradable poly( l-lactide )/ poly ( ethylene glycol) micro-降解到达92%,而MPLA在12周时仅降解50%;产capsules containing erythomycin by emulsion solvent evapo-物明显降低了对牛血清白蛋白的非特异性吸附。由ration technique. Joumal of Colloid and Interface Science,于该材料特殊的亲水性、降解性和抗非特异性蛋白2004, 271: 336-341质吸附的性质,预计在药物缓释材料和组织工程中14] Mallard s, Ameller T, Gauduchon J, et al. Inovaive dnug将有广阔的应用。delivery nanosystems improve the antitumor activity in vitroand in vivo of ani-estrogens in human breast cancer and mul-致谢:感谢重庆大学生物工程学院生物材料与仿生工.tiple myeloma. Jounal of Steroid Biochemistry and Molecular程中心对本课题的支持。Biolog, 2005, 94: 11-121[15] Vila A, Gill H, MaCalion 0, et al. Transport of PLA-PEG参考文献particles across the nasal mucosa: efct of particle size and[ 1] Kulkamni R K, Pani K C, Neaman C, et al. Polylactic acidPEG coating density. Joumal of Controlled Release , 2004,for surgical implants. 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J Mater Sci , Mater Med, 2005, 16:(4): 1417-1424万分数据赵明媚等:新型聚乙二醇接枝聚乳酸及其降解特性研究Synthesis and degradation of a new poly( ethylene glycol)-graft-poly(D ,L-lactic acid)Zhao Mingmei, Pan Jun, Wu Yanglan, Liu Ying, Li Yonggang, Wang Yuanliang(Biongineering College of Chongqing University, Chongqing 40044)AbstractA new poly( ethylene glycol) (PEG) graft poly(D, L-lactic acid) (PLA) was synthesized using maleic anhydridegraft PLA (MPLA) and amine terminated PEG (H2N-PEG-N2H) as raw materials. Its structure was confirmed via FTIRand 'H-NMR. The anti-non-specific protein adsorption property was visualized by fluorescent microscopic image with Flu-orescein 5- isothiocyanate (FTTC) conjugated bovine serum albumin ( FTTC- BSA). The hydrophility was tested throughwater uptake. Degradation was investigated by pH change and weight loss during 12 weeks. The results showed that H2N-PEG-N2H was scessully gafed onto MPLA and formed PPLA. Compared with MPLA and PLA, PPLA had prominentproperties of decreasing BSA adsorption and increased hydrophility and degradability, all of which may lead to its poten-tial applications in drug delivery and tissue engineering.Key words: poly( ethylene glycol), poly (D, L-lactie acid), graft, hydrophility, degradability中国煤化工MYHCNMHG-741一