利用联合生物工艺生产燃料乙醇的研究进展

广州化工2009年37卷第3期利用联合生物工艺生产燃料乙醇的研究进展廖礼斌山东化工高级技工学校,山东滕州27500)摘要:随着生物技术越来越多的介入到燃料乙醇的生产中联合生物工艺 consolidated biopricessing-CBP因其可将纤维酶生纤维素水解和酒精发酵融合于一步工艺中完成,更是成为其中的亮点。为使联合生物工艺成为可能以两种途径对所需微生物进行改造:一种是天然纤维降解微生物改造途径将天然存在的可降解纤维素的微生物,尤其是厌氧微生物进行改造,以使其适应CBP生产的要求;另一种是重组途径,通过基因重组的方式将不能降解纤维的微生物获得降解纤维素的能力,并且生产的产品性质符合CBP的要求。两种途径的对微生物的改造,无论从经济性和社会效益都将为高能耗时代的今天提供一种低成本的燃料乙醇生产方式。关键词:纤维素;燃料乙醇联合生物工艺重组途径Research on the Production of Fuel Alcohol by Consolidated BioprocessingLIAO Li-binShandong Chemical School of Senior Technicians, Shandong Tengzhou 277500, China)Abstract: Nowadays, with more and more biotechnology were used in the production of fuel alcohol,(CBP-featuricellulase production, cellulose hydrolysis and fermentation in one step-was becoming one potential approach for its outstandings. In general, consolidated bioprocessing CBP was enveloped through two strategies. One was accompished by reformingthe way of decomposing microbes by natural fibers. In order to meet the demand of the production of CBP, a reforming use wasmade for nature-born microbes especially oxygen-loathing ones. Another was accomplished by reconstructing, which enabledmicrobes can, t decompose fibers to acquire the ability of decomposing as well as to meet the demand of CBP. The above two waysno matter the consideration of economy and social benefits, can both offer us resolutions to produce fuel alcohol with less in-put at present-a time when everything was consumed too muchKey words: cellulose; fuel alcohol; consolidated; recombinant strategy为避免交通给城市带来的污染,要求使用无铅汽油的呼声日括生产纤维素酶产品的步骤底物和原料的消耗相对较低,所以益高涨叫。乙醇作为一种重要的燃料日益引起世界各国的重视尤生产成本低效率高。以使用酶与微生物的协同作用系统为例那其是将乙醇进一步脱水再添加适量汽油后形成变性燃料乙醇。在些以纤维素为食物的并可附着在纤维上的微生物在竞争纤维素国外乙醉被视为替代和节约汽油的最佳燃料具有廉价、清洁环水解产物方面要比那些不能附着的微生物吏具有优势。又由于保安全、可再生等优点。作为一种生物能源乙醇有望取代日益些杂菌也不能附着在纤维素上,这就增加了微生物分解纤维素减少的化石燃料(如石油和煤炭)。然而,目前汽油主要还是以石工艺的稳定性。在过去的几年中已经作了大量的工作去降低纤油为原料通过化学工艺生产,这对于经济的可持续性发展战略是维酶生产成本。相对于过去现在生产L乙醇的纤维酶成本大约不利的。因此世界上许多经济发达国家都注重以碳水化合物为是10-20美分/加仑是以前成本的十几分之一。这些进展降低原料发酵生产乙醇的生物技术开发。这其中作为植物生物物质了纤维酶的生产成本使以往在工业规模上无法实现的工艺成为的纤维素,由于其来源广泛,价格低廉是最适用于发酵生产乙可能。但是使用CBP工艺却可以在此基础上将成本进一步大幅醇的物质并且纤维素在转化过程中不产生温室气体,对环境无度降低害。但高昂的成本却阻碍了这些新技术的推广。为此,人们进行虽然CBP工艺可以大幅的降低纤维酶的生产成本,但是它了大量的研究简化工艺降低成本。其中将纤维素转化过程中的对所用的微生物却有较高的要求。所用的微生物必须比传统的纤四个中间转化过程(酶解生成葡萄糖将预处理过的生物物质中维发酵中国煤化工次好的产品构型。因此需的碳水化合物水解为糖,六碳糖发酵,五碳糖发酵)在一步工艺要对微中完成的联合生物T艺( consolidated bioprocessing)技术尤为值然纤维CNMHG个方面进行:一种是天天然存在的可降解纤维得注意。CBP相对于其它一体化程度较低的工艺过程因其不包素的微生物提高其产品的产率和性质;另一种是重组途径,是改作者简介:廖礼嘁,在职硕士研究生任教于山东化工高媛枝工学校。200年37卷第3期「州化工造不能分解纤维素的微生物,向其植入纤维酶系统,以使其能分在整个过程中其反应性不断降低)。因此进化途径对扩增异源纤解利用纤维素并表现出较高的产率。以下我们将对这两种途径维酶表达系统的理性设计还是有价值。现今,纤维酶的异源产品分别进行介绍。表达主要应于在酿酒酵母(s, cerevsiae)和以细菌作为宿主(工1天然纤维降解微生物改造途径程改造奥克西托克雷白杆菌 Klebsiellaoxytoca和可移动酵单胞菌2 ymomonas mobilis)的工程改造菌发酵生产酒精中。在奥克西托将天然存在的可降解纤维素的微生物尤其是厌氧微生物进克雷白杆菌( koxytoca)菌株中表达纤维酶可以增加微晶纤维素行改造以使其适应CBP生产的要求。这些研究的主要目的是提的水解率并且可以在使该菌株在无定型纤维素上厌氧生长。虽高纤维降解微生物代谢产物的产率,以适应工业化生产的需要。然已有数种葡萄糖降解酶可以在酿酒酵母(s. cerevisae)中表达有文献报道,对于可分解叶肉的但不能降解纤维的肠道细菌啊进但作为该酶的表达结果而使该菌株在纤维上厌氧生长却还未得行的改造收到了较好的效果。这些细菌在混合酸存在条件下的发到充分证明。最近, kondo和他的同事在不同菌株酿洒酵母(s.酵已经可以得到较高的产品收率。可是当应用于可以降解纤维素 cerevsiae)的细胞表面表达了纤维酶、木聚糖酶和淀粉酶在高的细菌时却遇到了诸多限制,主要原因在于缺乏合适的基因转换细胞密度下以重组酿酒酵母( s cerevsiae)菌株无氧发酵无定型技术。但近期的研究则表明有望突破这些限制。已经有对可降解纤维素、粗淀粉和木聚糖,他们每克底物的乙醇收率分别是纤维素的厌氧菌解纤维素梭菌( clostridium cellulolyticum)7]和热045g、044g和0.3g。已经在酿酒酵母( s cerevisiae)中功能性表达纤梭菌( clostridium thermocellum)阙基因转换研究的报道。在数种纤维二糖水解酶。重组纤维水解酶表现出的活性与天然纤2000年对解纤维素梭菌( C cellulolyticum)和2004年对热纤梭菌维水解酶相当。因此,增加表达水平是以后研究的重点。( C thermocellum)的研究中描述了这些微生物的电转化原则,包或许正如预料的那样,作为异源酶表达的结果,工程改造菌括一些具体的实验条件和仪器等。而对于以五碳糖为底物的可降可以在非天然底物上生长的能力对以可溶性底物生产乙醇要比解纤维素的嘈热厌氧菌 Thermoanaerobacterium them用纤维素生产乙醇更加有利。例如,可以将木糖发酵为乙醇的大arolyticum'和 Thermoanaerbacterium saccharolytium的外源基因肠杆(Ecol),酿酒酵母( scerevisiae)和可移动酵单胞菌(Zy-转换和表达的研究则是对不能发酵五碳糖的解纤维素梭菌(C. momonas mobilis)在1990年被改造出来。更近一段时间,具有thermocellum)基因转换研究的补充。根据2002的一份研究报告扩大的底物利用能力的数种酿酒酵母( 8. cereis]ae)菌株也被改造显示叫,对厌氧纤维素分解菌新陈代谢终产物的改造遇到了障出来:一种可以表达木糖异构酶的菌株在木糖上生长良好(最大碍。细菌表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶增多,导致乳酸盐减少,比生长率Umx=00%h-1)调;一种即可以表达细菌的L阿拉伯醋酸盐和乙醇增多。而在 T saccharolytic中,由于目标基因被去糖利用基因,又可以过量表达酵母的半乳糖通透酶基因的菌株也除而使其发酵产物中不再含有乳酸近来也实现了在其产物中去已被改造成功它可以发酵阿拉伯糖;一种B-葡萄糖酶表达菌除掉乙酸。并且在使用复制质粒得试验中电转化的高效率已经株在纤维二糖上的厌氧生长可以达到在葡萄糖上的生长水平;可足以去除微生物中的相似目标基因在天然纤维降解微生物改造发酵支链淀粉的酿酒酵母(8 ceresinE)菌株也已经开始进行前期途径中微生物对产品的耐受力是影响CBP可行性的关键。最近改造并且在不加淀粉酶的条件下达到较好的产率和产品浓度的研究已经实现了耐乙醇嗜热菌株的筛选和改造凹。所筛选的菌株可以在乙醇浓度超过6的环境下生长,而这个浓度已经足3影响CBP可行性的因素够使嗜热菌摆脱在以木质纤维素发酵乙醇的生产中所处的不利最近关于解纤维素梭菌( C thermocellum)利用纤维素的一位置。但同时也有报道显示解纤维素梭菌( C thermocellum)及其项研究为CBP的可行性提供了实验证据。实验显示解纤维素他嗜热菌发酵纤维素生产乙醇的产量被限制于26g/以下。因此,梭菌( C thermocellum)水解的纤维素产物的聚合度相当于4个我们认为要解决天然纤维降解微生物的乙醇耐受性与最大生产葡萄糖单位。因此,它的纤维素水解机理不同于真菌的纤维酶系浓度之间的矛盾可以通过代谢工程嘬大化乙醇产率来解决。统一其水解产物主要为纤维二糖。生理研究和以14C标记的纤维2重组途径素试验都显示,生长于纤维素上的微生物的生物能量效益取决于胞内低聚糖摄取过程中β-糖背键磷酸解的效率,并且这些效益不能降解纤维的微生物要想获得降解纤维素的能力,并且生超过了纤维素合成的生物能量成本。这项工作也解释了为什么天产的产品性质符合CBP的要求,可以通过基因重组的方式。这种生可降解纤维素的微生物能在纤维素上快速生长(例如在微品途径主要是通过改造异源纤维酶系统使微生物能在预处理过的纤维素上Umax0.16h-1),尽管厌氧发酵产生的ATP并不多。木质纤维素上生长发酵。如果促使生长的异源酶量表达的足够酶一微生物协同进一步增大了CBP的潜在可行性和效果多便可以用达到一定生长率所需要的具体酶量作为测定酶活得相比于酶微生物复合体,当使用纤维素一酶微生物复合体依据。有文献报道如果促使生长的纤维酶的比活力达到特定的水时由于纤维酶的水解效率得到提高这种可能性也会得到提高。平那么生长所需要的表达量也应符合要求调。已有关于酿酒酵纤维素池物的纤维素水解中占据母( saccharomyces cerevisia)w和大肠杆菌(Ecoi)吗在这个水中心位中国煤化工的专一性纤维素水解酶平的蛋白质表达报道但迄今为止还无活性纤维酶表达的相关报却仅仅CNMHG不包括可天然降解纤维素的活细胞。回到1956年纤维酶的先驱Reee和 Mandels观察重组途径的CBP改造可得到模型的支持。这个模型结合了到酶制备物即使在优化的条件下其水解率也大大低于培养中的生物发酵的能量因素和底物水解动力学(底物预先处理并且纤维降解微生物。因此定量评价酶微生物系统是未来重要的研广州化工2009年37卷第3期究课题,也可为CBP提供进一步的证据支持[10] Mai V, Lorenz WW, Wiegel J: Transformation of Thermanacrobacteriumsp strain JW/L-YS485 with plasmid plKMI conferring kanamycin re-sistance. FEMS Microbiol Lett 1997, 148: 163-167.CBP可以成为以酶或者微生物催化水解纤维素类物质转变[ Guerdon E. Desvaux M, Petitdemange H: Improvement o cellulolytic为酒精及其他产物的最廉价的工艺路线。因此,为进一步改进这roperties of Clostridium cellulolyticum by metabolic engineering Appl种低成本酒精生产工艺有必要继续利用上文提到的两种途径对Environ microbiol 2002. 68: 53-58.纤维素降解微生物进行改造以使这些微生物具有较高的酒精产12 Strobel HE, Lymn B: Proteomic analysis of ethanol sensitivitiy in Clostrid-um thermocellum. In proceeding of the National Meeting of the Ameri-率和较高的酒精耐受性。并且在这方面的成功将可以为利用纤can Society of Microbiology May 23-27th 2004. New Orleans, LA. Ab-维素低成本生产燃料乙醇技术带来一个长足的进步,从而带来可stract number 0-094观的经济和社会效益。[13]谢丽萍王正祥诸葛使利用可再生资源生产酒精的细菌酵母中的代谢工程[J]食品与发酵工业27(1263-68参考文献[14] Park EH, Shin YM. Lim YY, Kwon TH, Kim DH, Yang MS: Expression of[]王桂强浅谈从生物质制取液体燃料乙醇工艺辽宁化工,199928mucose oxidase by using recombinant yeast J Biotechnol 2000, 81:(5)271-2762]黄忠乾龙章富彭卫红农作物秸秆资源的综合利用资源开发与(15] Hasenwinkle D. Jervis E,KopO., Liu C, Lesnicki G, Haynes CA, K-市场,199151)32-34burn DG: Very high-level production and export in Escherichia coli of a3]曲音波高培基造纸厂废物发酵生产纤维素酶酒精和酵母综合工secretion-affinity fusion艺的研究进展食品与发酵工业,1993196)62-65ystem Biotechnol Bioeng 1997, 55: 854-863[4] Delucchi MA: Emissions of greenhouse gases from the use of transportation [16] Fujita Y, Ito L Ueda M, Fukuda H, Kondo A: Synergistic saccharificationfuels and electricity. Vol. 1. Argonne National Laboratory, Argonne, IL;amorphous cellulose by use of199Lengineered yeast strain displaying three types of cellulolytic enzyme[5] Greer D: Creating cellulosic ethanol. Spinning straw into fuel. BiocycleAppl Environ Microbiol 2004, 70. 1207-12122005,46:61-65[17] Zhang M, Eddy C, Deanda K, Finkelstein M, Picataggio S: Metabolic en-[6] Ingram LO, Aldrich HC, Borges ACC, Causey TB, Martinez A, Morales F,gineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic ZymomonasSaleh A, Underwood SA, Yomano LP. York SW et al: Enteric bacterialbilis Science 1995. 267: 240-243catalysts for fuel ethanol production. Biotechnol Prog 1999. 15: 855-866. [18] Kuyper M Hartog MMP, Toirkens M, Almering M/H, Winkler AA, Van[7 Jenner KCB, Tardiff C, Young DL, Young M: Gene transfer to ClostridiumDijken JP, Pronk JT: Metabolic engineering of a ryloscisomerase-axcellulolyticum ATCC 35319. Microbiol 2000, 146:3071-3080.[8] Tyurin M, Desai SG, Lynd LR: Electrotransformation of Clostridium ther-on. FEMS Yeast Res. 2005. 5: 399-409.mocellum. Appl Environ Microbiol 2004, 70: 883-890[19] Zhang Y-HP, Lynd LR: Cellulose utilization by Clostridium thermocel-[9]Klapatch TR, Guerinot ML, Lynd LR: Electrotransformation of ClostridiumMt assimilation. Proc Natl Acadthermosaccharolyticum. J Ind Microbiol 1996, 16: 342-347.Sci Usa2005,102:7321-7325.(上接冪65页)[ll] Bengu Sezen Dalibor Sames Selective C-Arylation of Free(NH-Heteroar [17 Martin, P. K, Matthews, H R, Rapopport, H, andThyagarajan, G. Tbeenes Via Catalytic C-H Bond Funon [JAm. Chem.Soc.of1, 4-Substituted Imidazoles [J. Orgchem, 1968 33, 3758.200312552745275.[18] Joseph L Hughey N Spencer Knapp, Harvey Schugar Dehydrogenation[12】嵇耀真武著有机合成路线设计技巧M北京出版社19842-Imidazolines to lm-idazoles with Barium Manganate UI-Synthesir3]王申生童乃斌2-苯基咪唑啉的合成及其在环氧粉末涂料的应用门热固性树脂,2002,17(5):9-12.[19] Amemiya, Yoshiya: Miller, Duan D: HSU, FULiun, Dehydrogenation of l[14] Busby Reginald E. Khan nachammad A. The reactions of imidazoles withommn,199020(16chloroform at500℃and24839.with trichloroacetate ion or heuachlooactone and bas U] Chem Soc. [20] Eissenstat, M A Weaver.D. a Retro-Diels-Alder Approach to Oxazoles19800)l427-1430and Imidazoles[].Org. Chem, 1993. 58.3387-3390.15] Helmut Schwarz,Tom Dockner, Uwe Kempe; Pre paration of imidazole[P [21] Casy, M; Moody, CJ, Rees, C W:a New Synthesis of ImidazolesUJJChem.US4340744.1982-08-20Soc. Chen. Commun. 1982.36,714-71[6]日本特许公报昭39-264051%6508-12.中国煤化工CNMHG