生物质转化燃料乙醇纤维素酶的研究

VoL 28 No. 3石油化工应用第28卷第3期June 2009PETROCHEMICAL INOUSTRY APPLICATION200年6月生物质转化燃料乙醇纤维素酶的研究年晓红(兰州石化职业技术学院石油化学工程系,甘肃兰州73006摘要:能源是人类社会经济发展的重要物质基础。随着石油资源的不断减少和环境问题的不断恶化,世界各国都在积极寻找解决能源和环境问题的方渎。其中,以生物质为原料的燃料生产,已经成为一些国家的能源发展战略而备受重视。本文通过对利用纤维素酶水解生物质原料生产燃料乙醇中纤维素酶的研究,分高提取出高活性的酶制剂降低酶的成本,使以生物质为原料的燃料生产实现规模化、产业化。关键词:生物质;燃料乙醇;纤维素酶;研究中图分类号:TQ35101文献标识码A文章编号:1673-5285(2009)03-0016-04由于经济社会的发展都是建立在能源尤其是化石燃料消耗的基础之上,所以,人类正面临着越来越沉重的环境污染和能源耗竭的压力各个国家都在积极寻找B/GB应对措施开发和利用生物质能源已经纳入到一些国家的能源发展战略中并相继制定了一系列开发研究计划CH2OH而燃料乙醇作为可再生清洁能源也日益受到广泛关注,是目前全世界科学家所重视的研究课题之图1纤维素结构示意图相对分子质量约500002500000,相当于300~以生物质为原料转化燃料乙醇的发展经历着三个阶段。第一阶段是以玉米、小麦为原料是发展燃料乙醇15000个葡萄糖基。分子式可写作(CHO5)n。不溶于的初始阶段。而利用粮食产品或油料作物虽然技术已水及一般有机溶剂。是植物细胞壁的主要成分纤维素经成熟但却面临着原料供应的问题。很显然仅依靠粮是世界上分布最广、蕴藏量最丰富的天然有机物也是食作为燃料酒精的原料,并非长久之计。第二阶段是非最廉价的可再生资源,占植物界碳含量的%以上棉粮燃料乙醇阶段以薯类等为原料但是薯类也在国家花的纤维素含量接近100,为天然的最纯纤维素来粮食统计范围内并且薯类生产有地域限制因此这源。一般木材中纤维素占40%-50%,还有10%-30%方案也不能完全满足未来的需要第三阶段是以秸秆等的半纤维素和20%-30%的木质素。此外麻麦秆、稻农业废弃物为主要原料的纤维素燃料乙醇。进入21世草、甘蔗渣等都是纤维素的丰富来源。纤维质中的纤纪各国政府和研究机构开始重视利用纤维素酶转化纤维素,经过生物降解和发酵过程可生产燃料乙醇。而且维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇,以避免对生物质能是一种可再生的资源,可满足人类持续发展粮食作物的大量损耗的研究和开发的需要。同时,它也是一种洁净的能源,纤维素能源植物在生长的过程中都能大量地吸收CO2,使用生物质1纤维素转化燃料乙醇技术能源不但不会造成对环境的危害,反而有利于改善环境11纤维素的结构及特点12纤维素转化燃料乙醇技术纤维素( cellulose)是一种多糖物质每个纤维素大维素在常温下不发生水解,高温下水解也很缓分子是由n个葡萄糖剩基(葡萄糖酐),彼此以1-4甙慢。只有在催化剂的作用下,纤维素的水解反应才显著键(氧桥)联结而形成的。如图所示进行,中国煤化工健素酶。因此利用CNMHG·收稿日期:200804作者简介:年晓红,女(1967-),辽宁大连,兰州石化技术学院讲师,主要从事工业分析、环境工程的教学及研究第3期牟晓红生物质转化燃料乙醇纤维素酶的研究纤维素转化生产燃料乙醇的主要工艺为:①预处理工有的两家能够生产纤维素水解酶的公司之一。诺维信艺即通过各种方法,如气爆法湿氧化法稀酸法或几公司与美国能源部合作将制造纤维素乙醇中的酶制剂种方法的组合破坏秸秆中的纤维素半纤维素与木质成本由2001年的每4546L3725元降低到2004年的素的结构,使之松散亦可使半纤维素水解②水解工224元,2005年又降低到每4546Ll35元。中国中粮集艺即通过酶法或酸法把上述物质中的纤维素、半纤维团生产一吨燃料乙醇需向诺维信支付大概2000元购买素水解成六碳糖和五碳糖;③发酵工艺选用特殊的共生物酶尽管这个价格只相当于诺维信给其它燃料乙醇酵菌种对上述六碳糖和五碳糖进行发酵生产酒精。生厂商的1/5,但仍然太高了。所以只有掌握核心技术其主要的化学方程式为研制出价格低到可以实现产业化的纤维素酶才有可能( CoHIdosn+nH4O→催化剂→ nAsH2O在纤维素生产生物乙醇这一未来市场胜出。CH2O6→催化剂→2C2HOH+2C02↑21纤维素酶纤维素水解过程可以采用酸水解和酶水解来实现。纤维素酶是一种复合酶属生物催化剂是水解纤维在酸水解工艺中可以使用盐酸或硫酸按照使用酸的素以获取葡萄糖的套复杂的酶系,它是由大约14000浓度不同可以进一步分为浓酸水解和稀酸水解。但是浓个葡萄糖残基通过bet-14糖苷键连接而咸的线性聚合酸腐蚀性强,而且从经济方面考虑必须回收浓酸增加了物其基本重复单位为纤维二糖。一般将其分为三类:工艺的复杂程度;而稀酸水解容易产生大量副产物。所1内切β-葡聚糖酶(EG),所有纤维素分解菌均以,一直以来酸水解法存在着工艺复杂能耗高,产品色能产生此酶,这些酶作用于纤维素分子内部的非结晶泽深以及污染环境等负面问题。同酸法水解工艺相比,区,能在纤维素分子内部任意切开β-1,4糖苷键产酶法水解具有反应条件温和、不生成有毒降解产物、糖生带非还原性末端的小分子纤维素。得率高和设备投资低等优点。但是,以纤维素酶转化纤2外切β葡聚糖酶或称纤维二糖水解酶(CBH)维素生产燃料乙醇也存在着诸多的障碍。此酶广泛存在于丝状真菌,可降解晶体纤维素将短链13纤维素酶转化纤维素生产燃料乙醇存在的问题的非还原性末端纤维二糖残基逐个切下,释放出纤维131原料的季节性和分散性的难题玉米秆、小麦二糖分子。秆、稻草等怎样收割运输存储都是一个大问题。经测3阝葡萄糖苷酶或称纤维二糖酶(BG),此酶广泛算1亩地才能收集到1吨秸秆,一个农民一天收两亩存在于微生物中,将纤维二糖及其它低分子纤维糊精地玉米秆需要4060元的费用。这是一个系统工程,包分解为葡萄糖分子。但是在分解晶体纤维素时任何括收购—打捆——运输等流程。种酶都不能单独完成水解过程,只有三种酶共同存132酶解成本过高,生产效率偏低目前使用的纤在并协同作用才能将品体纤维素水解为葡萄糖。进而维素酶的比活力较低单位原料用酶量很大酶解效率转化为燃料乙醇。低,产酶和酶解技术都需要改进。为了满足竞争的需22纤维素酶菌种选育要生产每4.546L乙醇的纤维素酶的成本应该不超过菌种选育是纤维素酶生产的基础性工作,细菌和053元。但在目前产酶技术条件下,生产4546L乙醇真菌产生的纤维素酶均可以水解纤维素物质。这些微需用纤维素酶的生产费用约为224元-373元。生物有好氧的,有厌氧的;有嗜温的、有嗜热的。1.3.3发酵工艺中缺乏经济可行的五碳糖发酵技术产生能分解纤维素的细菌如纤维粘菌、热纤梭菌纤维素酶水解纤维素制造乙醇的另一个问题是如何利及纤维杆菌等亦能分泌纤维素酶。用植物纤维原料中的戊糖(约占20%-30%)。既选用所有能分解晶体纤维素的真菌,均能或多或少的什么特殊的共酵菌种对上述六碳糖和五碳糖进行发分泌纤维素酶所以纤维素酶的真菌性来源非常广泛。酵,而纤维素酶的成本过高,是纤维素生产燃料乙醇例如:土壤中的微生物种类的数量巨大地球上近的一个急需解决的重大技术瓶颈它严重制约了生物40%-6%的纤维素被土壤中某些微生物所分解,因制燃料工业经济有效的大规模工业化生产。此,可以从+壇中获得纤维素酶的菌种。召中国煤化工约3-8cm的土壤层2纤维素酶的开发和研究中取村CNMHG刚果红染色法分离(涂布平板)生理生化鉴别反应等过程。即从土壤中分诺维信是全球最大的酶制剂生产商,是世界上仅离出纤维素酶高的细菌该菌应为革兰氏阳性菌体成石油化工应用200年第28卷杆状有芽孢。象因此如将几类菌混合在一起发酵,寻求使它们均能纤维素酶菌菌种易退化,退化后其产酶力明显降大量分泌纤维素酶的发酵条件和方法,就可以生产出低其原因可能有3个方面菌种长时间低温斜面保藏,优质高效的混合纤维素酶8会在分生孢子上长出次生菌丝而次生菌丝所形成的分24酶提取、分离纯化生孢子生命力弱这可能是菌种退化的主要原因;经诱纤维素酶的组分大多为糖蛋白,工业上用于生产变筛选的菌种发生回复突变;自然负突变;另外选择合纤维素酶的粗酶制剂常采用酒精沉淀法、丹宁沉淀法适的菌种保藏方法如用土壤或砂子作为载体的干燥保和离心喷雾干燥等方法。但在纤维素酶分析研究上主藏法可减缓菌种退化速度。此外提供良好的环境条件、要采用一系列蛋白质分离纯化技术如分级沉淀、色谱定期纯化菌种亦是防止菌种退化的主要措施。法电泳法等。目前,对粗酶的提取大多采用硫酸铵分虽然一般是从自然界分离筛选具有产生目标产物级沉淀法;对酶活力的测定国际上一般采用 Horikoshi能力的菌种但这样获得的菌种的生产能力往往较低,方法;对蛋白质的测定按考马斯亮蓝(Bdo法还原生理生化特性不一定能满足生产要求,还需要进行大糖的测定采用3,5一二硝基水杨酸(DNs)法。量的诱变选育进一步提高其生产能力,改善性能;也例如:高效液相色谱(HPLC),又称为高速或高压可以对现有的生产菌种进行改造,即经诱变育种,选育液相色谱,其分离或纯化各种化合物的原理基本上与出符合实际生产需要的菌株普通的液相层析相似。但高效液相色谱具有灵敏、快23菌种发酵培养及产酶活力的检测速、分辨率高及重复性好等特点,不仅适用于很多不易纤维素酶一般都是通过发酵生产的。目前所用菌种挥发、难热分解物质(如蛋白质、氨基酸及其衍生物、核主要是绿色木霉、李氏木霉、根霉、青霉、反刍动物(瘤酸激素、单糖、寡糖等)的定性和定量分析,而且也适胃细菌、真菌)嗜纤细菌产黄单孢菌侧孢菌等其中用于上述物质的制备和分离特别是近10年来出现了绿色木霉应用最广。纤维素酶是一类胞外酶从培养物几种与HPLC相近的快速蛋白液相色谱(FC)低压滤液中很容易得到,它又属于诱导酶在诱导物存在下液相色谱(LPLC)和中压液相色谱(MPLC),其中FPLC才能大量产生。许多不溶性纤维素可溶性纤维素衍生能在惰性环境下,以极快的速度通过成百上千次层析物、一些低聚糖及某些单糖和二糖均可作为诱导物。研把复杂的混合物分开如果连续进样,短时间内能制备究发现在分批培养物发酵过程中起初pH值最好是出大量的欲纯化物质。自然下降到30-35,再加以控制以防止pH降低消耗另外,为了在生产中有利于酶的回收和再利用应纤维素后自然上升,这样有利于酶的大量分泌。连续培采用纤维素酶的固定化。其优点主要表现在:养时保持pH-50可提高酶产量因为低pH会抑制菌1酶与产物易于分开因而可以回收再利用;的生长。影响纤维素酶产量和活力的因素很多,除菌2在一定程度上可以改善酶的操作性能和稳定性;种pH外还有培养温度、水分、基质、培养时间等。这3可以多次反复使用和连续操作降低生产成本;些因素不是孤立的,而是相互联系的。酶不混入产物,可以精简分离工序等。例如:以某绿色木霉作为纤维素酶的生产菌株,采用液体发酵对筛选菌株进行滤纸酶活性、脱脂棉酶活3结论性、CMC酶活性、β-葡萄糖苷酶活性测定,筛选出1株产纤维素酶活性较高的菌株。通过单因素实验和正交纤维素酶的研究实验主要从菌株选育、菌种发酵实验确定该菌株摇瓶发酵产纤维素酶的最佳培养基和培养和产酶活力的检测以及酶提取分离纯化三方面最佳培养条件。结果表明最适的产酶条件为以玉米人手。通过实验得到能大量生产高活力纤维素降解酶秸粉(爆破)为碳源以0%(NH)04为氮源。pH为系的发酵用菌,并通过筛选、修饰基因改造等分离新50,接种量4%-6%,摇床转速150mmin,发酵培养温度的产酶菌种提高酶的产量和活力以降低产酶成本;28℃-32℃,培养时间72h-96h。酶作用的最适条件为:改进酶的回收利用;改变天然纤维素酶的结构,以提高温度45℃-50℃,pH4.5-50;在45℃左右,pH35-60比其酶作V凵中国煤化工工业和市场潜力的较稳定。纤维素酶活力可达到1256/mL新酶CNMH⑤趋势之一。也是解另外,在研究中拟采用混合微生物发酵法。因为不决利用纤维素酶水解生物质原料转化燃料乙醇中成本同真菌的纤维素酶系在各组分均衡性方面有互补的现过高的一个重要手段。并在一定程度上解决纤维素生第3期年晓红等生物质转化燃料乙醇纤维素酶的研究产燃料乙醇的主要技术问题。使之能够符合大规模,工邮学财余晓斌周洪汤蕾,正交旋特组合设计优化纤堆素业化的生物乙醇生产围。酶发罅碳源门食品与机械,2005,21(3)29-31]孙君社李雪秀芹纤雄素酶高产萬株的选育及产酶条件参考文献的研究门北京林业大学学报,2002,(2)25-27.[]岳国君武国庆邮小明我国燃料乙醇生产技术的现状与展团7] Hidenori Tanaka,, Toshihide Nakamur, Sachio Hayashi乱望化学进展20098:1084-1090Purification and Properties of an Extracellular Endo-1,4-82]李盛贤贾树彪顾立文利用纤维原料生产燃杆酒精的研Xylanase from Penicillium citrinum and Characterization of究进展门酿酒2005(3):13-16.the Encoding Genel Journal of Bioscience and Bioengineering,3]宋波,邓晓皋,施雷霆纤绰酶的研究进展印上海环境科2005,100(6):623-630学,2003,22(7:491-494.8]顾方媛纤維素酶的研究进展与发展趋势微生物学杂志,4]佘晓就邮学财纤维肃酶液体发酵最佳培养基的确定门工2008,(1):4547业微生物2005,35(3):1-5.Biological material transformation fuel ethanolcellulose enzymes researchDeparyment Of Petrochemical Engineering, Lanzhou Petrochemical CollegeOf Technology, Lanzhou 730060, China)Abstract: Energy is an important material basis for human society economic development, With dwindling oilresources and worsening environmental problems, Countries around the world are actively finding solutions to energynd environmental problems. Among them, biomass as raw materials to fuel production, already became somenational the energy developmental strategy to be subject to takes seriously. In this paper, the use of celluloseenzymatic hydrolysis of biomass feedstock in the production of cellulose ethanol fuel research, Isolation of highenzyine acty and reduce the cosof enzyme so that biomass fuels as raw materials to achieve the scale ofproduction and industrialization of.Key word: biological material; fuel ethanol; cellulose enzyme; research更正启示2009年第2期46页作者魏美吉,李天太,杨玲,姚瑞峰《苏里格气田温气输送管线析出水变化规律分析》一文,图2鬍更正为右图。b由于疏忽给作者及读者带来不便,深表歉意!中国煤化工CNMHG《石油化工应用》杂志社2009年6月25日