注银热解碳的抗菌机理研究

第28卷第2期天津师范大学学报(自然科学版)Vol 28 No. 22008年4月Journal of Tianjin Normal University(Natural Science Edition)Apr.2008文章编号:1671-1114(2008)02-0031-04注银热解碳的抗菌机理研究才学敏,郑津辉,赵杰(天津师范大学a物理与电子信息学院;b化学与生命科学学院,天津300387)摘要:使用草兰氏阳性繭——一金黄色葡萄球菌,对注银热解碳的扰菌机理作了探讨分析.银离子的注入能量为70keV,注入剂量分别为5X10,1X1016,5×10ion/cm2,用俄歇电子能潘(AES)和X射线光电子能谱(XPS对样品表面进行了薇观分析,结果表明:材料表面形成了富银屡;对注银剂量相同的热解碳,直接接触的抗菌效果比其滤液的抗繭效果好,说明注银热解碳的抗菌作用是溶出的银离子和未溶出的树料表面络合状银离子的共同抗结果,且杀酋以银离子溶出为主关键词:热解碳;银离子注入;抗菌机理中图分类号:R318.08;0484.1文献标识码:AOn bactericidal mechanism of pyrolytic carbon with silver implantedCAI Xuemin, ZHENG Jinhui, ZhAo Jieb. College of Chemistry and Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China)Abstract: By using Staphylococcus aureus which is a kind of Gram-positive bacteria the bactericidal mechanism of pyrolytic carbon with silver implanted is studied. Energy of silver ions implanted is 70 keV, and doses of that are 5104, 110, 5X10 ions/cm. By using auger Electron Spectroscopy and x-ray Photoelectron Spectroscopy thesurface microstructure of samples is analyzed. The results show that Ag-rich layer is formed on the surface of mate-rial. For the pyrolytic carbon samples with same dose of silver implanted the bactericidal effect of touching directly isbetter than that of its filtrate. It means that the dissolved silver ions and the complex silver ions on the surface ofmaterial resist bacteria jointly, and the dissolved silver ions play the more important roleKey words: paralytic carbon; silver ion implantation; bactericidal mechanism生物医学材料是生物系统直接作用于组织或器因此热解碳具有抗断裂强度高和相对低的弹性模官的治疗增强或替代的材料.因而须要满足各种量,以及相当好的耐磨和耐疲劳性能;(3)热解碳具生物功能对材料理化性质的要求,且不会因与生物有无刺激不致癌的特性抛光后的热解碳涂层具有系统直接结合而减弱其功能和使用寿命.人工心脏致密不透性,不会引起降解反应;(4)热解碳还具有瓣膜是指用机械或者生物组织材料加工而成的可以见的抗血凝性能可直接应用于心血管系统这也用来代替病损心脏瓣膜功能的人工器件.目前由正是热解碳十分流行的最主要原因.另外,银作为一种优良的抗菌剂,自古至今已有广泛的应用它于制造机械瓣叶最流行的材料是低温各向同性碳在手术过程中及术后均能起到很好的抗菌作用2(LTIC),简称热解碳.(1)医用碳素材料与其他金本研究是在注银热解碳具有明显抗菌性研究的属材料相比,是一种化学惰性材料故热解碳具有很基础上(,对材料表面进行AES和XPS的微观分好的生物相容性在体内不会产生对机体有害的离析,月中国煤化工果的测试,初步探子;(2)医用碳素材料具有良好的“生物力学性能”,讨了CNMHG收稿日期:2007-1基金项目:国家自然基金资助项目(10475061);天津市自然科学基金资助项目(033607911)第一作者:才学敏(1983-),女,硕士研究生通讯作者:赵杰(1943-)男教授从事凝聚态物理、离子注入方面的研究. E-mail; jiezhao1943@126.cm32·天津师范大学学报(自然科学版)2008年4月其2倍浓度的细菌悬液b.用微量加样器取菌液a各1实验1mL,分别加入无菌真空盒(培养盒)的各孔中.再从1.1实验样品的制备已灭菌的样品组中各取半份量的样品,分别放入已实验所使用的高纯热解碳人工心脏瓣膜,其中加菌液a的各个孔中并编号;用微量加样器取菌液的S含量为0.01%石墨相含量为24%其他杂质b各0.5mL,分别加入培养盒的各孔中,取步骤1)含量均小于0.001%.使用北京师范大学低能核物中的每组样品滤液各0.5mL,分别加入已加菌液b理所研制的金属蒸汽弧源( MEEVA)离子注入机进的各个孔中并编号.行银离子注入.样品双面注银的编号和注入参数见3)把步骤2)中的培养盒放入转速为150r/min表1.的摇床上,恒温37°C,培养24h.衰1样品编号及其注入参数4)用微量加样器取与样品及样品滤液共培养后样品编号R/mmE/kevI/mA注人剂量的菌液,从每个编号孔中各取0.1mL,接种于已灭(ion·cm-2)0菌的含培养基的培养皿中,每个编号样品各3个平5×1014行操作,均匀涂布平板后,平放于实验台静置20~1X10165X101730min,使菌液渗人培养基表层内.将标明相应编号的培养皿放人37°C的恒温箱里培养24h.1.2样品结构特征测试5)用体视显微镜观察,并用数码相机记录培养1.2.1AES测试皿里的菌落数,按下式计算各个样品的抗菌率采用美国PHI公司生产的PHI-610扫描俄歇电子能谱仪,分析样品表面的成分及薄膜成分沿深FA-B、×100%度的变化采用同轴电子枪和CMA能量分析器,其中,A,B分别对应相同面积内未注银对比样品其电子枪高压能量为3kev能量分辨率为0.3%,和注银样品与细菌作用之后培养皿里的菌落数入射角30°,分析室真空度为52×10Pa.深度分析中离子束的溅射条件为:扫描型Ar离子枪,面积2结果与讨论为1mm×1mm,溅射速率约为30nm/min,能量为2.1注银热解碳的结构特征分析3.0keV,发射电流为25mA2.1.1AES分析1.2.2XPs测试样品A3(注银剂量为5×10ion/cm2)的银随利用美国PH公司生产的型号为PH15300X光深度分布的AES谱图见图1,曲折的曲线为实验测电子能谱仪对注银剂量5×10ion/cm2热解碳样品量值,光滑曲线为高斯拟合后的曲线.由图1可进行表面元素分析的定性、半定量化学价态分析.看出银的分布为非对称的高斯分布,其最大浓度为分析室真空度优于.3×10Pa,用于对样品进行清4.5%,注人深度为750mm左右.银元素浓度的高洁和定量剥离的离子源的溅射速率为1nm/min,斯分布都向靶材表面发生了偏移,这主要是由于离Ar+能量为3.5kev,束流为25mA子注入时的溅射效应,使得靶材料表面向内部有了1.3抗菌试验迁移从而使高斯分布相对向表面迁移,导致了注入采用平板菌落计数法进行抗菌性能测试平板离子的非对称高斯分布菌落计数法是将待测样品经适当稀释,使其中的微生物充分分散成单个细胞.取一定量的稀释样液接种到平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形FT FilterExperment成肉眼可见的菌落,即每一个单菌落代表原样品中一个单细菌.统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出原样品中所含的菌数5.本实验选用的菌种为金黄色葡萄球菌,具体步骤如下:1)从已灭菌的样品组A,A1,A2,A中各取等M凵中国煤化工量样品,加入磷酸盐缓冲液(PBS)1mL,放在转速CNMHG度分布图为150r/min的摇床上,恒温37°C,24h之后,将样2.1.2XPS分析品取出,得到滤液图2是样品A3(注银剂量为5×107ion/cm2)2)用PBS液稀释原菌液分别制成细菌悬液a及表面的XPS谱图.由图2可知,热解碳注银以后第28卷第2期才学敏,等:注银热解碳的抗菌机理研究33·表面富银,在能量为275eV处有很强的Cls峰对步骤(5)给出的公式计算各样品的抗菌率(表2)应热解碳的基底;在能量375eV处对应着较强的银饔2各组样品抗率的Ag3d峰.同时,在600eV左右,还有Ag3p,样品编号Ag3p3峰说明表面存在不同价态的银,可能有AgAgO,Ag2O,Ag2CO等表明注银样品表面确实存AAAA02895在不同价态的银,富银的表面具有抗菌作用3×10°从表2可以看到,注银热解碳具有明显的抗菌效果,且无论对于直接接触还是间接接触抗菌率均随注银剂量的增大而增大;对于注银剂量相同的样器2×10品,直接接触的杀菌效果比间接接触(滤液)的杀菌效果好;对于样品A3无论直接接触还是间接接触,5X1杀菌效果均为100%可能当注银剂量达到一定程度,滤液中的银离子可使等量的细菌全部杀死2.3注银热解碳的抗菌机理图2样品A3表面的XPS谱图由上述抗菌试验结果分析可知,间接接触的方式2.2抗菌试验结果也同样具有较好的抗菌效果,说明注银热解碳的滤液2.2.1定性观察与分析具有抗菌作用,即材料中溶出的Ag*起抗菌作用;对抗菌试验结果的部分照片如图3所示于注银剂量相同的样品,抗菌材料直接接触菌液比其滤液接触具有更强的抗菌作用,说明注银热解碳直接接触菌液时,除了溶出的Ag+起抗菌作用外,材料表面未溶出的络合状银离子也有抗菌活性;这些说明注银热解碳的抗菌作用是银离子溶出抗菌和接触抗菌共同作用的结果,且杀菌以银离子溶出为主对于注银热解碳的抗菌效果直接与银离子从热解碳中的溶出有关,溶出量的多少决定了抗菌效果对于一定注银剂量的热解碳银离子的溶出量直接决定于热解碳的微观结构和溶出时间.该材料表面的SEM形貌的实验结果表明热解碳表面为多孔的层A。对应未注银样品状结构,该结构使材料的表面积增大,注入的银更容A2对应注入剂量为1×101ion/cm2的样品易从材料中游离出来同时也扩大了细菌与材料的接A3对应注入剂量5X10ion/cm2的样品A2对应注入剂量为1×1016ion/cm2的样品滤液触面,因而具有很好的杀菌效果.通过24h和42h图3对应样品A、A2、A2、A3的菌落图片的样品滤液杀菌效果对比,后者的抗菌效果明显优于前者.表明给予的溶出时间越长,抗菌效果越好由图3可知,没有注银的样品A。没有抗菌效从生理学的角度研究银离子的抗菌机理是一个果,可见有大量的菌落分布;样品A2和A3均具有十分复杂的问题虽然人们已经进行过大量的研究很好的抗菌效果,且样品A3的抗菌效果更好,几乎但对杀菌的具体生理过程尚未全面了解.目前,主要看不到菌落.样品A2的直接接触和间接接触A2有3种有关银的抗菌机理(样品滤液)均具有较好的抗菌效果,但直接接触的第一种是银离子溶出型抗菌机理.细菌在生存杀菌效果比间接接触的杀菌效果好.在未注银的对环境中当银离子浓度相对过高时会影响其生长繁照样品A中细菌的存活性很好,在显微镜下看到殖,从而起到杀菌作用.初级的破坏作用体现在:当的粘稠的白色物质是细菌新陈代谢旺盛的产物,而细菌V凵中国煤化工改变了正常的生注银样品则没有,表明银抑制了细菌的新陈代谢使物膜CNMHG离子浓度差从而其无法正常生长阻碍或破坏细胞维持生理所需的小分子和大分子物2.2.2样品抗菌率的定量分析质的运输.更深入的破坏作用体现在:当微量银离统计对应各个样品培养皿中的菌落数,通过实验子到达细菌细胞膜时因细胞膜带有负电荷银离子·34天津师范大学学报(自然科学版)8年4能依靠库仑引力牢固吸附细胞膜,与膜蛋白结合,导法逆转.这是因为细菌不具备高等动物完整的细胞致细胞立体结构损伤产生功能障碍但细菌此时仍骨架及快速的修复功能,从而造成最终的损伤,具有一定的生命力;当银离子聚集量达到一定程度时,它会穿透细胞壁进入细胞内部,与蛋白质、核酸3结论中存在的巯基(-SH)、亚氨基(一NH-)等含硫、1)由AES和XPS测试与分析得出,注银热解含氮官能团发生反应,甚至破坏或置换维持酶活力碳表面含微量银且呈不同价态银随深度的分布为所必需的金属离子,如Mg2+,Fe”和Ca2+等,使细非对称的高斯分布,正是富银的表面起着抗菌作用菌的蛋白质沉淀或失去活性造成固有成分被破坏2)注银热解碳直接接触的抗菌率和其滤液的抗或产生功能障碍而导致细菌死亡,当菌体被银离子菌率均随注银剂量的增大而增大;对于注银剂量相杀灭后银离子还可以从细菌中游离出来,又和其他同的样品,抗菌效果前者较后者更好说明注银热解细菌作用.如此周而复始,使其具有持久抗菌性其反应如下:碳的抗菌作用是溶出的银离子和材料表面未溶出的络合状银离子的共同抗菌结果,且杀菌以银离子溶蛋白质-SH+Ag蛋白质-SAg↓+H出为主;当注银剂量达到一定程度,如样品A3注入蛋白质核酸-NH+Ag+剂量为5×10ion/cm2时,两者的抗菌作用是相同蛋白质核酸-NAg++H+的,均为100%从外形上观察细菌质壁分离,细胞壁失去完整3)注银热解碳的抗菌效果直接与银离子从热解性和对渗透压的保护作用,细胞膜破裂,组织液外碳中的溶出有关,抗菌率与溶出时间成正比.此外,流,细菌凋亡,这源于菌体内有大量中毒颗粒,可注银热解碳的多孔层状结构,方便了银离子的溶出能是菌体内大量蛋白质变性沉淀的结果和细菌的吸附,因而具有良好的抗菌效果第二种是银的接触抗菌机理.注银热解碳表面参考文献是富银层,由于Ag未饱和的配位能力,通过静电吸[]卢水要,崔振怿,杨贤金,等.各种材料在人工心脏瓣膜中的附周围环境中的细菌,与菌体表面的N或O作用应用[].金属热处理,2004,29(9):23-破坏菌体表面活性结构导致菌体因生理变化或活2郭希铭,刘谦祥,唐慧琴,等银离子注人对TN薄膜和热解动受阻而死亡,碳抗蘭性能的影响[冂].天津师范大学学报:自然科学版,2006,26(1):40-第三种是光催化抗菌机理.在光的作用下,材[3]刘棚,唐琴,张魁,等银离子注入TN再膜的抗菌性和抗料表面的微量银起到催化活性中心的作用,激活水腐蚀性研究[.天津师范大学学报:自然科学版,2007,27(1)和空气中的氧,产生羟基自由基(·OH)及活性氧离13-16.子(O),而活性氧离子具有很强的氧化能力,能在[4唐慰琴,郑律辉,刘桐,等银离子注人热解碳的抗菌性研究几短时间内破坏细菌的增殖能力,致使细胞死亡,从而真空科学与技术学报,2006,26(2):93-97达到抗菌的目的.因为银离子本身并不消耗,只起催[5]沈萍,范秀容,李广武微生物学实验(3M北京:高等教育出版社,1999:93.化剂的作用,所以也具有持久的抗菌效果[6]夏金兰,王春,刘新星抗菌剂及其抗菌机理[几中南大学学报此外,银的抗菌作用与自身的化合价态有关,抗自然科学版,2004,35(1):31-37菌能力按下列顺序递减:Ag+≥Ag+≥Ag+.蛋7]马玉龙,许样荣离子型无机抗菌材料研究进展材料导报,白质以胶体的形式在菌体中存在,高价银离子比低04,18(2):16-18.价银离子使胶体凝聚的效率大,蛋白质沉淀也就更[8] Feng Q L, Wu J, ChenGQ, et al a mechanistic study of the anti-cterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococus容易,抗菌作用也越强.此外,高价态银的还原势极aureus]. J Bomed Mater Re, 2005, 26: 662-668高并容易使体系产生原子氧,产生高效抗菌作用.[9]厕祚万,楚珑晨,段小飞无机抗菌材料的产业化现状[门新材曾用小鼠成纤维细胞L929作过注银热解碳的细料产业,200,36:20-23胞毒性研究试验表明银离子对细胞的毒性很小,为[10]唐篡琴,刘欣,刘桐,等注银热解碳生物相容性的研究U10级或1级,这对高等动物来说,可以认为是无毒功能材料,2006,37:680-683.[11]的.然而,对于细菌却表现出极强的抗菌性,目前已有中国煤化工au]. Nature Medicine研究者在沙门氏菌和大肠杆菌中发现抗银基因1CNMHG这些基因表达的最终产物大多是膜蛋白在转录调整2scterial silver resistance: Molecular biology and系统的控制下完成对银离子的绑定搬运,最终将银ses and misuses of silver compounds [J]. FEMS MicrobiologyReviews,2003,27:341-353.离子排出胞外.但是,银离子的强抗菌作用,依然无(責任蝙校李宏伟)