乙醇消耗菌的分离鉴定及其对基因工程集胞藻乙醇产量的影响

第38卷第3期水生生物学报Vol. 38. No. 32014年5月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAMay,2014doi:10.7541/2014.69乙醇消耗菌的分离鉴定及其对基因工程集胞藻乙醇产量的影响葛平平·2陈林1张维董庆喆刘天中吕雪峰(1.中国科学院青岛生物能源与过程研究所,生物燃料重点实验室,青岛266101;2.中国科学院大学,北京100049)摘要:为研究产乙醇基因工程集胞藻培养液中的乙醇消耗菌污染情况及其对乙醇产量的影响,从污染的培养液中分离岀4株乙醇消耗菌,通过16SrNA、26 SrNA序列分析对分离岀的菌株进行鉴定,并研究其乙醇消耗能力及对基因工程集胞藻乙醇产量的影响。结果表明,分离岀的4株菌分别为红酵母( Rhodotorulap)、季也蒙酵母( Meyerozyma guilliermondii)、短波单胞菌( Brevundimonas sp.)、微杆菌( Microbacterium sp.)。其中乙醇消耗能力最强的是红酵母,乙醇比消耗速率达到391g(10-3cfud);其次为季也蒙酵母,乙醇比消耗速率为80.1g(10 cfu.d);短波单胞菌和微杆菌的乙醇比消耗速率远低于红酵母和季也蒙酵母。将分离出的菌株与产乙醇集胞藻共培养πd后,污染红酵母、季也蒙酵母、短波单胞菌、微杄菌的实验组乙醇产量分别下降了53.8%、23.6%、40.7%、27.3%。4株菌对基因工程集胞藻的生长无明显影响,均通过直接消耗乙醇而降低集胞藻的乙醇产量。关键词:乙醇消耗菌;微生物污染;生物乙醇;基因工程集胞藻中图分类号:Q949,22文献标识码:A文章编号:1000-3207(2014)03-0487-08生物乙醇是重要的生物液体燃料之一,可作为巴氏醋杆菌、门多萨假单胞菌等都可代谢乙醇61,汽油替代品或可再生交通燃料添加剂。应用基因其中巴氏醋杆菌的乙醇消耗速率达到2.3mL/d。而工程蓝藻直接利用太阳能和CO2一步法生物合成乙在管囊酵母2、酿酒酵母叫中,乙醇的合成代谢和醇具有独特的优势,因此成为各界关注的热点2分解代谢同时存在。如果污染了这些微生物,也可目前,用于生产乙醇的基因工程蓝藻主要有聚球藻能严重影响乙醇产量。目前,关于微生物污染对基( Synechococcus sp.PCC7942)和集胞藻(Sme-因工程集胞藻乙醇产量的影响还未有报道。chocystis sp.PCC6803)3等,最高乙醇产量达到本研究从污染的产乙醇基因工程集胞藻的培养5.5g冮,显示出太阳能生物转化直接合成乙醇的液中分离出4株乙醇消耗菌,评价各菌的乙醇消耗巨大潜力。然而,有研究表明基因工程集胞藻的乙能力以及对基因工程集胞藻的生长和乙醇产量的影醇产量很不稳定,在培养后期培养液中的乙醇浓度响,并采用形态观察和基因序列分析手段鉴定污染急剧下降5,因此研究确定影响乙醇产量稳定性菌的种类,以期能为蓝藻乙醇的培养工艺及污染控的因素对生产工艺的建立有重要意义。制提供理论参考。在我们的前期工作中发现,基因工程集胞藻在培养过程中易发生食藻生物和微生物污染,尤其是1材料与方法在放大培养阶段这种污染尤为严重。食藻生物会吞1.1藻种及培养方法食藻细胞,使生物量迅速下降,从而降低乙醇产量。产乙醇基因工程集胞藻 Synechocystis sp.PCC自然界中存在着多种能利用乙醇的微生物,例如醋6803Syn-zG25,由中国科学院青岛生物能源与过酸菌、面包酵母、嗜有机甲基杆菌、枯草芽孢杆菌、程研究所构建。集胞藻在250mL三角摇瓶(装液收稿日期:2013-04-10;修订日期:2013-12基金项目:国家高技术发展计划(863)(2012AA052103)资助作者简介:葛平平(1988),女,河北保定人;硕士研究生;主要从事生物化工TYH中国煤化工通信作者:陈林,Te:0532-80662737;E-mail:chenlin(@qibebt.ac.cnCNMHG488水生生物学报38卷量100mL)或直径30mm的气泡柱式光反应器(装液提取的基因组DNA为模板,用高保真aq酶进行量200mL)中培养,通入含5%CO2的空气混合气,PCR扩增。反应条件为:95℃5min;94℃30s,55℃通气速率(102)Lh,光强100μmol(m2s),培养温1min,72℃lmin,34个循环;72℃10min。PCR产物度(302)℃。培养基为BGlⅠ培养基,其中含用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检验。目的基因片段克20mg/L壮观霉素( Spectinomycin, Sigma)4隆:将PCR产物用DNA纯化试剂盒( Cycle-Pure Kit1.2乙醇消耗菌的分离纯化美国 Omega公司)进行纯化,产物与pMDl8-TⅤec-培养基(1)初筛培养基:牛肉膏3gL,蛋白胨tor连接后转化到E. coli dh5α感受态细胞中,涂布10g,NaCl5gL,乙醇2g/L,壮观霉素20mg,到Amp抗性平板上培养9-16h挑取3个单克隆琼脂15g/;(2)复筛培养基: BGll培养基中添加扩繁后送上海桑尼生物科技有限公司测序,将测2g/L的乙醇,20mg/L的壮观霉素,15g/L的琼脂;序结果与 Gen bank中已有序列进行比对和同源性(3)纯化培养基:牛肉膏3gL,蛋白胨10g/L,NaC1分析5g冮,乙醇2gL,琼脂15g/L(4)发酵培养基:牛1.4乙醇消耗菌的生长及乙醇消耗速率测定肉膏3gL,蛋白胨10gL,NaCl5gL,乙醇23g乙醇消耗菌生长曲线的测定挑取纯化后的单壮观霉素20mg/L菌落接种于发酵培养基中培养24h,取适量培养液乙醇消耗菌的分离及纯化(1)初筛:集胞藻在在6600nm下测定其吸光度(A6o),然后稀释至A6o=气泡柱式反应器中通气培养12—14d后,经无菌检0.05,按10%接种量接种至发酵培养基中,于30℃测为阳性,作为染菌藻液。取染菌的Syn-ZG25藻液,180rmin摇床中培养,定时取样测定菌液A60。每经梯度稀释后涂布于初筛培养基平板上,置于30℃实验组设2个平行,对照组中接种等体积的无菌培生化培养箱中培养。待平板上有单菌落长岀后,依养液。据菌落形态和显微观察结果,分别挑取多株菌落菌液细胞浓度的确定取生长至对数期旳菌液形态和显微形态相同的单菌落培养。(2)复筛:将初测定其A6。梯度稀释后采用平板活菌计数法测定筛得到的各菌株分别在复筛培养基平板上划线或细胞浓度,计数时仅选取菌落数在20-200的平板凃布,平板放置于30℃生化培养箱培养7—10d,每株菌每浓度做3个平行。用 Origin拟合出菌液A6长出的菌株在纯化培养基平板上经多次传代后作与细胞浓度D( Cell density, cfu/mL)的关系,结果列为复筛菌株。入表1。1.3乙醇消耗菌的鉴定菌落及个体形态观察在纯化培养基平板上,表菌液A60与其细胞浓度D的关系Tab. Ionship between A660 and cell densit利用目测法观察乙醇消耗菌的菌落形态。挑取纯化菌株编号关系式拟合系数后的单菌落接种于发酵培养基中,培养24h后取适量菌液低速离心,收集菌体,依次使用2.5%戊二醛GRI3D=1.179×103A6o+68.120.994GTID=2327×1010A60+62750.990溶液和1%锇酸固定,经乙醇梯度脱水后喷金处理GW13D=5641×103A6+16.670.996然后用冷场发射扫描电子显微镜(S-4800型,日本GY22D=2.036×10A60+97540,994Hitachi公司)进行个体形态观察。乙醇消耗菌的16 RdNA及26 S rDNA序列测定乙醇消耗速率的测定将培养18-24h后的各根据各菌的菌落和个体形态分析,4种菌可能分属细菌接种到裝有20mL发酵培养基的锥形瓶中,根据菌和酵母两大类,因此同时进行了16 S rDNA及26s拟合得到的公式将培养液适当稀释,使其初始细胞rDNA序列测定。引物设计:分别选用16 S rDNA通浓度维持在10° cfu/mL,将锥形瓶置于30℃、180rmin用引物对27F(5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)摇床培养。以不接菌实验组为对照,每组实验设21492R(5 TACCTTGTTACGACTT-3)以及26 SrNA个平行。每6h取样测定细胞浓度,并用生物传感分通用引物对NL1(5′ GCATATCAATAAGCGGAGGA析仪(SBA-40D,山东省科学院生物研究所)测定培AAAG3)NL45 -GGTCCgTGTTtCaaGaCGg-3)。养液中乙醇浓度4PCR反应体系与条件:PCR反应采用50uL体系,以乙醇的比消耗速率按公式(1)计算:中国煤化工CNMHG期葛平平等:乙醇消耗菌的分离鉴定及其对基因工程集胞藻乙醇产量的影响489(1)和采用平板活菌计数法测定菌的细胞密度。(2-1)·D1.6基因工程集胞藻生长的测定其中,Q为比消耗速率,单位为g(cfud);C,表示1考虑到乙醇消耗菌在730nm处也有光吸收,因时刻的乙醇浓度,单位为g;D为1到t2时间段内此以叶绿素a的含量计量集胞藻的生物量。取1mL藻液,离心收集藻细胞,再加入1mL甲醇重悬浸泡,的平均细胞浓度,按照公式(2)计算60℃水浴避光提取30min,离心取上清液测定665nmD=-下的吸光度,计算叶绿素a含量S17统计分析1.5乙醇消耗菌对基因工程集胞藻乙醇产量的影响统计分析采用单因素方差分析( One-Way ANOVA无菌藻种在三角瓶中培养至对数生长期后,授方法,使用SPSs1.0软件。种于气泡柱式光生物反应器(装液量200mL)中,每24h取样,测定藻液的叶绿素a含量及乙醇浓度。自2结果培养第4天始,向各实验组中分别接种稀释至一定2.1乙醇消耗菌的分离及鉴定细胞浓度的菌液2mL,使各乙醇消耗菌细胞终浓度从污染的基因工程集胞藻培养液中,经过初筛、为Io° cfu/mL,对照组加入2mL无菌水;每组实验多次纯化及复筛,得到4株具有乙醇消耗能力的菌,设2个平行。每24h取样,测定藻液的叶绿素a含分别编号为GR3、GW13、GT17、GY22四株菌分量及乙醇浓度。对照组及实验组每48h作无菌检测别在30℃恒温箱中培养5d后的菌落特征列入表2。表2四株乙醇消耗菌的菌落特征Tab 2 Colony characteristics of the four ethanol consuming microorganisms菌株编号菌落直径菌落颜色菌落形状边缘正反面颜色差别olonyColony colotSurface Color difference of both sideGRI3红色圆形,帽子状整齐无45纯白色圆形整齐无0.8—1乳白色圆形整齐光滑无GY22橘黄色圆形,帽子状整齐光滑无扫描电镜观察显示(图1)GR13菌的细胞为球形或椭球形细胞直径约24m;GW13菌的细胞呈卵球形,长度约1.53μum,GTl7菌的细胞呈杆状,直径约为03um,长度约1-2um。GY22菌的细胞呈短杆状,直径GR13约0.30.4μm,长度约0.81.2μum。综合考虑四株菌的菌落和个体形态,初步认为GRl3和Gw13属于酵母菌,GT17和GY22属于细菌。随后分别提取各菌的DNA,并进行16 S TDNA及26SrDNA序列测定,将测得的序列在 Genbank blast进行同源性图1四株乙醇消耗菌的个体形态比对(表3)Fig. I The morphology of the fouH中国煤化工CNMHG水生生物学报38卷表3四株乙醇消耗菌的同源性比对结果Tab 3 BLAST results of the four ethanol consuming microorganisms菌株编号序列长度生物名同源性盖率Strain number Sequence length(kb)MicroorganismIdentity(%) Cover(%)GRI3Rhodotorula sp. M26100Meyerozyma guilliermondii strain KAMLO5GW13Meyerozyma guilliermondii strain KAMLo3GTI1385Brevundimonas terrae strain KSL-145Mycoplana bullata strain IAM 13153979Microbacterium hominis strain DSM 12509GY221444Microbacterium trichothecenolvticum strain DSM 8608Microbacterium testaceum strain DSM 20166100从比对结果可以看出,菌株GRI3、GT174株菌的初始接种浓度均为10°cfu/mL,在此GW13、GY22分别与黏质红酵母( Rhodotorula mue条件下,发酵培养基中乙醇浓度变化见图3。其中vinosa)、缺陷短波单胞菌( Brevundimonas diminuta对照组由于自然挥发的原因,乙醇浓度略有下降。ATcC11568)季也蒙酵母( Meyerozyma guilliermondii在扣除因自然挥发而消耗的乙醇后,除了GY22外,strain Kaml05)人型微杆菌( Microbacterium hominis其他三个实验组中的乙醇浓度均显著下降(P0.05)。由此可见,在本实验条乙醇产量的影响件下,4株菌的存在虽然明显降低培养液中乙醇浓度向无菌集胞藻培养液中分别加入不同的乙醇消(图6),但对TH影什492水生生物学报38卷耗菌。K詛 maraine,eral.的研究证明培养液中乙醇→GRl3浓度为4.5gL时,可以对集胞藻PCC6803的生长产--GT170.030F-GW13生明显抑制,导致最高细胞浓度下降4.5%1。本研0.025究发现基因工程集胞藻在培养过程中容易染菌,并从中分离出4株能够代谢乙醇的菌(表2,3)。图7的结旨0.020果表明,4株菌在BGll培养液中均表现出明显的乙醇消耗能力,GR13、GW13、GT17、GY22的乙醇消0.010耗速率分别为0.051、0.022、0.038和0.026g(Ld),在0.005°营养更丰富的发酵培养基中的乙醇消耗速率更高髙0.000分别达到1.7、2.05、0.725和0.025g(Ld)(图3)。在培养时间 Culture time(d本研究中使用的基因工程藻株 Synechocystis sp.PCC图7四株乙醇消耗菌对集胞藻生长的影响6803Syn-zG25的乙醇产率为0.0090.104g(Ld),Fig. 7 Effects of the four microorganisms on growth of Syneche与上述分离的菌株共培养7d后,实验组的乙醇产量cystis sp均显著低于无菌对照组(图6)。当培养液中无乙醇消响,据此也能推测乙醇浓度的降低主要是由于污染耗菌时,乙醇产量呈现增长趋势;当培养液中污染的乙醇消耗菌对乙醇的直接消耗。少量乙醇消耗菌时,乙醇积累速度减缓。随着培养液中乙醇消耗菌浓度的增加,污染乙醇消耗速率较3讨论低的杂菌的实验组,乙醇浓度不再增长;污染乙醇基因工程集胞藻是在野生型集胞藻PCC6803中消耗速率较快的杂菌的实验组,乙醇浓度迅速下转入表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的基因,构建降。在本研究中菌株GRl3的乙醇消耗能力最强,其出乙醇合成途径,通过光合作用固定CO2直接合成乙醇比消耗速率为391g(103cfud。目前报道的基乙醇。研究表明,有很多种因素会影响乙醇合成途因工程蓝藻的最高乙醇产量为0.21g(Ld),据此径中关键酶的活性,从而影响藻细胞的乙醇产率,计算,若要将菌株GR13对乙醇产量的影响控制在Gao,etal.的研究结果表明当培养基中存在较高浓1%以内,则其最高细胞浓度应控制在537×l0 cfu/mL度的Zn3、Co3等金属离子时,乙醇脱氢酶的活性受以内。抑制S。Lan,etal发现富氧条件下相关酶的活性受些研究表明,某些细菌能通过分泌溶藻物质,抑制,相应地,藻细胞的产醇能力降低16。但在直接破坏藻细胞;或者与藻细胞竞争营养和光照Deer,eal、Gao, et al!的研究中即使在上述扣制因而抑制藻细胞的生长。而本研究中分离到的4株乙醇素并不存在的情况下,集胞藻培养液中的乙醇积累消耗菌与基因工程集胞藻共培养时,并未对集胞藻量仍然表现出快速下降的现象35。Gao,eta认为的生长产生明显抑制(图7),而与此同时,培养液中因藻细胞的衰老而引起的乙醇产率降低是乙醇积累乙醇的积累量岀现明显差异,说眀本研究中的几株量迅速下降的主要原因。而本研究发现即使在生乙醇消耗菌并非通过抑制藻细胞的生理状态而影响长末期藻细胞不产生乙醇,自然挥发也只是导致乙其乙醇产量,而是通过消耗产物乙醇而导致乙醇产醇浓度略微下降(图3)。 Deer,etal猜测是乙醇脱氢量的降低。酶反向催化乙醇转变成乙醛,但没有阐明导致代谢经形态和分子鉴定,本研究中分离的4株菌分方向转变的原因3别属于红酵母属、季也蒙酵母属、短波单胞菌属和基因工程集胞藻的目的产物乙醇可通过自由扩微杆菌属。 Okada,etal.、 Verduyn,etal.的研究表散透过原生质膜,直接分泌到胞外,从而在培养液明9某些酵母兼有生产和消耗乙醇的能力,两中积累一定浓度的乙醇。从产物回收的角度看,从种代谢的方向取决于培养液中可利用糖的浓度,当培养液中而非从藻细胞中回收目的产物相对较容易,培养液中糖浓度较高时,酵母发酵产乙醇;当培养成本也相应降低。而就培养本身而言,乙醇的积累液中糖浓度较低时,酵母就会消耗乙醇。而产乙醇可能对藻细胞产生胁迫或导致培养液中滋生乙醇消集胞藻培养使围无机养石相础相对匮乏,因中国煤化工CNMHG期葛平平等:乙醇消耗菌的分离鉴定及其对基因工程集胞藻乙醇产量的影响493此污染的酵母可能从发酵产乙醇转变为消耗乙醇,ethanol [J]. Chinese Journal of Applied Environmental从而降低培养液中的乙醇积累量。本研究还发现,Biology,2009,15(4):559562[陈亮,郑军,张益霞,等短波单胞菌和微杄菌也能够消耗乙醇,有文献报道株乙醇利用菌的分离及其在乙醇含量测定中的应用显示短波单胞菌能够代谢利用乙醇2,而微杆菌消应用与环境生物学报,200,15(4:559562][9 Sun Z Y, Niu T G. Isolation and identification of a Bacillus耗乙醇的报道还不多见。sp degrading alcohol [J]. Food Research and development在规模培养中,由于反应器的非完全密闭性、2006,27(7):77—79[孙志一,牛天贵.一株能够有效解酒培养环节众多和培养周期较长等原因,很难做到绝的芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定.食品研究与开发对避免菌的污染。而且在不同培养情况下,污染菌2006,27(7):77-79株的种类和对目标藻类和目标产物的影响机制也各[10 LuC C, LiZ L, LiY R, et al. Screening identification of astrainpotentiality in ethanol detoxification and有不同。本研究分离出的几株菌广泛存在于环境中,optimizition of its culture conditions J. Liquor-Making容易造成规模培养中的污染并大量消耗乙醇而影响Science Technolog,2011,6(204):17-20[陆晨晨,李宗乙醇产量,尤其是短波单胞菌、微杆菌因为体积微亮,李盈叡,等.一株乙醇降解菌株的筛选、鉴定及其培养条件的优化.酿酒科技,2011,6(204):17-20小(直径约为03pm),容易通过用于制备无菌空气1 Xiao JB, Jiang H X, Chu SY. Isolation and Characterization的过滤器而造成污染,在未来的研究和生产中应该of Denitrifying Bacterium Pseudomonas Mendocina aHD7加以重视。因此,本研究通过对几株乙醇消耗菌的分with Anaerobic Ammonium Oxidization [A]. In: Sustainable离鉴定并评价其乙醇消耗速率,有益于人们了解基Environment and Transportation. Applied Mechanics and因工程集胞藻培养过程中乙醇产量下降的原因,也Materials, May 2012, Stafa, Zurich [C]. Trans Tech有助于认识微藻培养中污染菌的性状和污染途径,Publications. 2012. 699-703[12 Maleszka R, Schneider H. Concurrent production and并就此可进一步发展针对性的污染控制方法。Tannophilus growing on D-xylose [J]. Applied and参考文献:Environmental Microbiology, 1982, 44(4): 909-912[13] Pham H T, Larsson G, Enfors S O. Growth and energy[1 Balat M, Balat H. Recent trends in global production andmetabolism in aerobic fed-batch cultures of saccharomvcesutilization of bio-ethanol fuel [J]. Applied Energy, 2009,Cerevisiae: simulation and model verification [ JI861):2273-2282Biotechnology and Bioengineering, 1998, 60(4): 474-482[2 Woods R P, Smith C R, Kramer D, et al. Geneticall[14] Ge P P, Chen L, Lu X F, et al. 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Biofuel, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China;2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)Abstract: Four ethanol consuming microorganisms(GR13, GW13, GT17, and gY22)were isolated from the contami-nated culture of genetically engineered Synechocystis sp. and were utilized to evaluate the effects of these microorganisms on the ethanol consuming capabilities and ethanol productions of Synechocystis sp. Based on the morphologicalcharacteristics and 16S rDNA and 26S rDNA gene sequence, the four strains were identified as Rhodotorula sp, Meyerozyma sp, Brevundimonas sp, and Microbacterium sp, respectively. We observed that strain gri3(Rhodotorula sphad the highest level of specific ethanol consumption rate [391 g/(10 cfu- d)], followed by strain Gw13(Meyerozymasp,[80.1 g/(10 cfu- d). While strains GT17(Brevundimonas sp. and GY22(Microbacterium sp. had much lowerethanol consumption rate. All four strains did not significantly affect the growth of Synechocystis sp, however, theyremarkably decreased the ethanol production of Synechocystis sp. The results of the co-culture experiment demonstratedthat strains Gr13, GW13, GT17, and GY22 diminished ethanol production of the genetically engineered Synechocystissp. by 53. 8%, 23.6%0, 40.7% and 27.3%, respectivelyKey words: Ethanol consuming microorganism; Microorganism contamination; Bioethanol; Genetically engineeredSynechocystis sp中国煤化工CNMHG