非病毒基因载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺的合成及其结合DNA能力的研究 非病毒基因载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺的合成及其结合DNA能力的研究

非病毒基因载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺的合成及其结合DNA能力的研究

  • 期刊名字:功能材料
  • 文件大小:625kb
  • 论文作者:罗昕,潘仕荣,冯敏,张璇,张未,温玉婷
  • 作者单位:中山大学
  • 更新时间:2020-07-10
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论文简介

罗昕等:非病毒基因载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺的合成及其结合DNA能力的研究297_非病毒基因载体聚乙二醇聚乙烯亚胺的合成及其结合DNA能力的研究罗昕1.2,潘仕荣',冯 敏”,张 璇',张 未',温玉婷1(1.中山大学附属第一医院广东广州510080;2.中山大学药学院,广东广州510080)摘,要:以IPDI为偶联剂,合成了PEG-PEI接枝共关键的问题是如何将DNA转人到靶细胞之中,进而聚物,用FT-IR、H NMR对共聚产物进行结构表征确进人细胞核,从而实现基因的转录与表达。介导基因认,通过'H NMR计算出共聚物的分子量,并通过琼传递的载体主要分为病毒型载体和非病毒载体,阳离脂糖凝胶电泳试验考察共聚物与DNA的结合能力。子聚合物是一类常用的非病毒载体凹,其中聚乙烯亚结果表明,成功合成了PEG-PEI共聚物,当PEG接枝胺(PEI)是目前应用较有效的阳离子聚合物基因载量为10% .25%时,PEG-PEI结合DNA的能力没有受体好。PEI的结构特点是分子中每隔2个碳原子就有到明显影响;当PEG接枝量为50%时,PEG-PEI结合一个氮原子,这些氮原子在生理条件下可以发生质子DNA的能力有所下降。化而带上正电荷,从而与DNA.上带负电荷的磷酸基关键词:非病毒基因载体;聚乙二醇;聚乙烯亚胺;异团通过静电吸附作用而形成复合物。但PEI作为基因佛尔酮二异氰酸酯;琼脂糖凝胶电泳载体的最大缺点就是细胞毒性太大,聚乙二醇(PEG)中图分类号: TQ316;Q523文献标识码:A是无毒无免疫原性的水溶性大分子,具有优良的生物文章编号:1001-9731 (2008)02-0297-04相容性[] ,本文通过使用PEG修饰PEI,制成嵌段或接枝共聚物(图1),以期改善其作为基因载体的性能,1引言并通过琼脂糖凝胶电泳试验考察PEG修饰后是否会基因治疗是近年来新兴的一种治疗手段,其中最降低PEI结合DNA的能力。CHo-ECHCH20],CHCH2OHmPEGIPDINCODBTLCHChCHACHNCO70~75C/10hCHo-ECH2CH.o}].CH.CH20-t-NHmPEG-NCOPEINHzCHRkCHNCODBTUCHCIH2NE~NH}h;EN~ 子,Nh2| 65C/24hCH2o-FCH2CH.o].CH.CH2OC-NHPEG-PEICHxEKCH.NH- t NHE~NHJ,{N~ JINH2.图1 PEG-PEI 的合成路线Fig 1 Synthesis of PEG-PEIBruker 公司) ,AVANCE AV 400超导核磁共振谱仪(瑞2材料与仪器士Brucker公司),DYY-6C型电泳仪(北京市六- -仪器聚乙烯亚胺(Mw25000,支链型,无水, AldrichrSig-厂),UVIpro凝胶成像系统(英国UVMtec公司)。ma公司),单甲氧基聚乙二醇(mPEG,M。= 750、.2000.3实验方法5000,Fluka公司),异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI,进口分装,广州市汇采涂料化学品有限公司),二月桂酸二丁基3.1 原料的预处理锡(DBTL,广东丽宝涂料助剂公司),氯仿、乙醚.油醚3.1.1氯仿(30~60C)等均为分析纯(广州化学试剂二厂)。临200"^千愠外棚后的干水氯化钙加人氯仿,放EQUINOX 55型傅里叶变换红外光谱仪(德国置过中国煤化工滤除去氯化钙,将滤IYHCNMHG_●基金项目:国家 自然科学基金资助项目(30570500)收到初稿日期:2007-07-25收到修改稿日期:2007-10-08通讯作者:潘仁荣作者简介:罗昕(1978-),男,广 西梧州人,在读博士,师承潘仁荣教授,主要从事生物材料的研究。_298功村料2008年第2期(39)卷液与IPDI在60C下回流4h,以除去微量的水分和乙(含 0. 2pug/ml澳化乙锭作为显色剂),1XTBE作为电.醇,最后将氯仿蒸出,干燥器中保存备用。泳缓冲液,电压90V,电泳时间50min.电泳结束后于3.1.2单甲氧基聚乙二醇凝胶成像系统中观察并拍照。将mPEG加入三颈瓶,油浴加热使之熔融,升温4结果与讨论至110C ,搅拌下抽真空,脱水处理4h,干燥器中保存备用。4.1共聚物的合成3.2单甲氧基聚乙二醇的活化mPEG分子上有活性基团-OH,PEI分子上有活称取mPEG于恒压滴液漏斗中,加人适量氯仿,性基团-NH2,IPDI分子具有两个活泼基团异氰酸酯振摇使之溶解;另量取8~30倍摩尔量过量的IPDI于基,可以分别与PEG的一OH及PEI的- -NH2反应。三颈瓶中,加入适量氯仿,搅拌以分散均匀;在搅拌的本文利用IPDI作为偶联剂将PEG与PEI通过共价键情况下将mPEG滴人IPDI中,并加入0. 6%~0. 7%连接成为接枝共聚物。IPDI 的两个异氰酸酯基,一个的DBTL作为催化剂。滴加完毕后用水浴加热至70直接接在环己烷体系的环上,另一个接在环,上侧链的~75C回流反应10h,回流结束后将反应液倒人10倍亚甲基上,它们的反应活性并不相同,在许多情况下,量的石油醚中以析出沉淀,沉淀物用石油醚洗涤多次接在环.上的一NCO的活性比侧链上的一NCO的活性.后用少量氯仿溶解,再用10倍量的石油醚沉淀,如此大的,因此mPEG优先与环上的一NCO反应,使得反复操作多次以去除过量的IPDI.最后将沉淀物抽IPDI不会同时接上两个mPEG,此外我们通过控制反真空干燥,得白色粉末(mPEG5000-NCO、mPEG2000-应条件,即IPDI大大过量并采用mPEG逐滴滴人IP-NCO)或淡黄色粘稠液体(mPEG750-NCO)。DI的加料方式,进-步减少了mPEG-IPDI-mPEG的3.3共 聚物的合成产生。Petersen等[5]采用六亚甲基二异氰酸酯(HD-称取定量的mPEG-NCO于恒压滴液漏斗中,加MI)作为偶联剂,由于HDMI的两个- -NCO是对称结人适量氯仿,振摇使之溶解;另定量称取PEI于三颈瓶构,活性相同,因此有可能同时与两个mPEG反应而中,加人适量氯仿,搅拌以分散均匀;在搅拌的情况下无法再与PEI反应。第一步的活化反应结束后必须将将mPEG-NCO滴人PEI中,并加人0. 6%~0.7%的过量的IPDI除去,否则残余的IPDI的两个一NCO可DBTL作为催化剂。滴加完毕后用水浴加热至65C导致PEI分子间发生交联反应。IPDI 可溶于石油醚回流反应24h,回流结束后蒸去部分氯仿浓缩反应液,而mPEG-NCO不溶于石油醚,因此我们通过用大量将余下的浓缩液倒人20倍量的乙醚中以析出沉淀,沉的石油醚反复沉淀和洗涤mPEG-NCO以除去残余的淀物用乙醚洗涤后真空干燥,得白色蜡状固体. IPDI. 在第二步的共聚反应中,每个PEI分子上都有(mPEG5000-PEI .mPEG2000-PEI)或淡黄色粘稠液体多个氨基- - NH2 ,都可以与mPEG-NCO反应,为避免(mPEG750-PEI).分别制备PEG接枝量为10%、一个 PEI分子接上过量的PEG,我们采用在搅拌的情25%、50%(质量比)的PEG-PEI共聚物一共9种,分况下 将mPEG NCO逐滴滴入PEI 的方式来加料,以别记作750-10、750-25 、750-50、2K-10、2K-25、2K-50、保证共聚产物分子的均匀性。5K-10 ,5K-25、5K-50。3.4共聚 物的表征原料、预聚体及共聚物的IR图谱如图2所示。在3.4.1 IR 分析图2(a)中,3482cm-1左右的宽峰是mPEG羟基的取mPEG .mPEG NCO、PEI、PEG-PEI,用其氯仿0- -H伸缩振动,2886cm~的吸收峰是长链上亚甲基溶液涂硅片制备样品,扫描范围4000~400cm-.的C-H伸缩振动,1109cm-1的吸收峰是醚键C-3.4.2 'H NMR测定0- C的伸缩振动。图2(b)为mPEG-NCO,保留有以氘代氯仿为溶剂,在室温25C下进行。mPEG长链上亚甲基的C-H伸缩振动(2876cm-1)3.5琼脂糖凝胶电泳试验及醚键C-0-C的伸缩振动(1107cm-1),与图2(a)DNA分子由于磷酸基团带负电荷,在电泳槽中会相比,多了1716cm-'(mPEG的一0H与IPDI脂环上向阳极迁移,带正电荷的PEI与DNA结合形成复合的一NCO反应生成的氨酯羰基的伸缩振动)和物后可以阻滞DNA在电场中的迁移。PEI 与DNA2267cm“'(未参加反应的另一个一NCO的伸缩振动)的相对比例可以用N/P比(即PEI,上氨基氮与DNA两个强吸收峰,表明mPEG与IPDI发生了化学反应,上磷酸基1团的摩尔比)来表示,完全阻滞DNA在电泳成为带有活性基团-NCO的预聚体mPEG-NCO.在槽中迁移时的N/P比可以作为评价聚合物载体结合图2(d中国煤化工PEI氨基的N- -HDNA能力的指标。伸缩拆MHCNMHG二峰是PEI链上亚甲将质粒DNA(pEGFP-CI)与PEI、PEG-PEI按N/基的 d共聚产物PEGPEI,P比分别为0、0. 5、1.2、3.4、5、6混合,室温静置保留了PEI的N-H伸缩振动(3285cm-1).PEG和30min,使之形成复合物。电泳条件;0.8%琼脂糖凝胶PEI 链上亚甲基的C- -H伸缩振动(2872cm-')、以及罗昕等:非病毒基因载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺的合成及其结合DNA能力的研究_299预聚体中氨酯羰基的伸缩振动(1712cm-1),与图2(b)亚胺单元质子的化学位移。在图3(b)中,8.42的峰为相比,2267cm-1处- NCO 的吸收峰消失,表明一-NCOmPEG长链上乙二醇单元质子的化学位移,8.378的峰参加了化学反应,同时增加了1651cm-1的吸收峰(预”为链端甲氧基质子的化学位移,82.002的峰为链端羟基聚体的一-NCO与PEI的一-NHz反应生成的脲羰基的质子的化学位移,83.817的峰是与端羟基相连的亚甲基伸缩振动),表明mPEG-NCO与PEI发生了共聚反质子的化学位移。在图3(c)中,83.ou9和8.s22的多重峰应,生成了共聚物PEG PEI.为IPDI上与脂环-NCO相连的次甲基质子的化学位移(分别对应IPDI顺、反两种异构体),8.ou6(单峰)和8, 194~3.378(四重峰)为IPDI上与脂环侧链- -NCO相连的亚甲基质子的化学位移(分别对应IPDI顺、反两种异构体),8.07_1.1的峰是与脂环相连的甲基质子的化学位移,81-1.256和81.7u9-1.026 的峰为脂环上亚甲基质(C)PE2267/子的化学位移[时。图3(d)为mPEG-NCO,与图3(b)PEGPEMWi相比,82.002处mPEG链端羟基质子的峰消失,表明mPEG的一OH与IPDI发生了反应;与图3(c)相比,保留有83.0处与IPDI脂环侧链- -NCO相连的亚甲基4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500质子的峰,表明mPEG活化成功,成为带有活性基团图2原料及共聚物的IR图谱-NCO的预聚体mPEG-NCO,且表明与mPEG羟基Fig 2 IR spectra of materials and copolymers反应的是脂环上的-NCO而非脂环侧链上的一NCO.4.3 H NMR的测定图3(e)为PEG-PEI,与图3(d)相比8.09处与-NCO原料、预聚体及共聚物的'H NMR图谱如图3所相连的亚甲基质子的峰消失,表明预聚体mPEG-NCO示。在图3(a)中,8545-2.78之间的峰为PEI链上乙烯与PEI发生了反应,生成了共聚物PEG-PEI.间)阳向mPEG(C) IPDI4.00 3.503.00 2.50 2.00 1.501.00 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.004.003.503.002.502.001.501.00间) mPEG-NCO(@)PEGPE|5鼎4.003.50~3.002.50-2.00 1.501.00 4.00 5.50 3.00 250 2.00 1.50 1.00x10*图3原料及共聚物的'H NMR图谱Fig 3 'H NMR spectra of materials and copolymers根据共聚物的'H NMR图谱(图3(e))中乙烯亚Wra% =Wrc, x100% .胺单元(82.s-s.o)与乙二醇单元(83.。)中质子峰积分面’WPeG+WPe积之比,可以计算出共聚物中PEG与PEI两组分的质分子量:量比以及共聚物的分子量,结果见表1.MmWPc= ApEc/4X 44中国煤化工%Wret Ape/5X 43YHCN M H子的数目,接枝数:其中4、5和44、.43分别表示上述两个单元的质子M。二Mre数和分子量.”=一Mro接枝量:对于分子量较小的PEG750来说,偶联剂IPDI的_300料2008年第2期(39)卷分子量(222.28)对共聚物分子量的计算影响较大,在为 N/P=0即裸DNA,可以看到跑出的条带荧光很计算过程中必须予以扣除.亮,表明DNA在电场中发生了迁移。第2~8泳道分表1 PEG-PEI 共聚物的组成及分子量别为N/P=0.5.1.2.3、4、5、6的聚合物与DNA的复Table 1 Compositions and molecular weights of PEG-合物,从图中可见,随着聚合物载体的量逐渐增加,PEI copolymersDNA的电泳迁移逐渐受到阻滞,条带的荧光逐渐变刚得接桂量接枝数分子董弱,甚至消失,直至完全被阻滞在点样孔里. PEI 在样品名投料比Wrc/Wru(%)n|M。N/P=3时就可以完全阻止DNA的迁移,共聚物750-750-10 f mPEG750: PEI=1+9| 13.86 T 4. 1429. oK10、750-25、2K-10、2K-25、5K-10、5K-25在N/P=3时750-25 mPEG750s PE1=1↑319.91| 6. 3931. 2K都可以完全阻止DNA的迁移,表明PEG的接枝量在750-50 mPEG750: PEI=1 : 144. 9821. 0245.4K2K-10mPEG2K: PEI=1 :910.47 1. 32 27.9K .10%和25%时并没有削弱PEI结合DNA的能力;共2K-25| mPEG2K: PEI=1*3| 26.96| 4. 1534.2K聚物750-50、2K-50、5K-50在N/P=4时才可以完全2K-50 mPEG2Ks PEI=11 153. 1212. 75|53.3K阻止DNA的迁移,表明PEG的接枝量过大时会削弱5K-10| mPEG5K: PEI=1 :911.26 0. 6128. 2K5K-25 mPEG5Ks PEI=1 1325.081.6033.4KPEI结合DNA的能力。在PEG接枝量相同时,不同_5K-50 mPEG5K PEI=1; 152.00 5. 19 52.0K分子量的PEG对PEI结合DNA的能力并没有明显#由NMR法计算求得。的影响。4.4琼脂糖凝胶电泳试验各样品的电泳图谱见图4.每块凝胶的第1泳道PEI750-10750-25750-5012345678 12345678 12345678 12345678 123456782K-252K-505K-105K-255K-50图4聚合物/DNA 复合物的琼脂糖凝胶电泳图谱Fig 4 Agarose gel electrophoresis of polymer/DNA complexes72; 115-125.5结论[2] Godey WT, Wu KK, Mikos AG. [J]. J Cotolled Re-以IPDI为偶联剂,合成了PEG-PEI接枝共聚物,lease, 199, 60; 149-160.经FT-IR,'HNMR对共聚产物进行结构表征确认生[3] Kakizawa Y. Katoka K. []. Adv Drug Delivery Re-views, 2002, 54; 203-222.成了PEG-PEI共聚物,并通过'H NMR计算出共聚物[4]尹伟,储玖龙. [J].徐料工业,1999, 2; 34-36.的分子量。琼脂糖凝胶电泳试验结果表明,当PEG接[5] Petersen H, Kunath K, Martin AL, et al, [J]. Biomacro-枝量为10%、25%时,PEG PEI结合DNA的能力没有molecules 2002, 3(5) :926-36.受到明显影响;当PEG接枝量为50%时,PEG-PEI结[6]汪雷敏, 播铁英,史新梅,等.[J]. 波谱学杂志,2005,合DNA的能力有所下降。22(1): 79-84.参考文献:中国煤化工MHCNMHG[1] Godey wT, Mikos A G. [J]. J Controlled Release, 2001,(下转第304页)304功能材料2008年第2期(39)卷WC-12%Co层梯度过渡层长了模具使用寿命,降低了产品成本,对提高我国模具制造业的国际竞争力具有重要的战略意义。参考文献:[1] 新野正之,平井敏雄,渡边龙三.[J].日稻复合材料学会冷却管Zn合金层环倒树脂+铝粉NiCrAIA志,1987 ,13(6) :257-264.[2] Koizumi M,Nino M. []. MRS Bulletin, 1995,20(1), 19-(低熔点合金)21.图6 FGM模具断面结构简图[3] 郭成,朱维斗,金志浩.[J].稀有金属材料与工程,1995 :Fig 6 Structural diagram of the FGM mould cross-sec-(3);18-25.tion[4]金卓仁,毛样武,程继 贵. [J].合肥工业大学学报,2001,1.60-63.5结论[5] Pan Chunxu, Xu Xiaorong. [J]. Surface and CoatingsTechnology,2003.162;194-201.熔射成形制备梯度功能材料工艺简单、效率高,可[6] Gu Y W,Klor K A.Fu Y Q,et al. [J]. Surface and Coat-以得到大厚度优质涂层,改善了不同材料间的界面结ings Technology,1997 ,96(2-3) :305-312.合性能,解决了复合材料界面突变产生的应力集中而[7] Sampath S, Smith W C,Jewett T J,et al. [J]. Materials导致涂层脱落问题。Science Forum,1999 ,308-311 :383-388.等离子熔射制备的WC-20%Co/NiCrAI系FGM[8] Takigawa H,Koga M. Proc of the First Inter[C]. Japan;组织结构呈连续变化,断面硬度呈梯度分布,表面耐磨Symp on FGM Sndai;1990. 247-252.性能较传统钢材有较大提高,制造成本低、周期短,是[9] Yoshikazu s, Yoshio I, Susumu L [J]. ISI International,1992 ,32(8) :893-901.新材料的发展方向和必然趋势.FGM模具快速制造技术缩短了模具开发周期,延Preparation of functionally graded materials by plasma sprayingZHAO Zi-yu,ZHANG Su zhi, F ANG Jian-cheng(College of Mechanical Engineering and Automation, Huaqiao University ,Quanzhou 362021 ,China)Abstract;Functionally graded materials (FGM) are a new material with special structures and characteristics,and it would contribute to improve the traditional materials industry by further research of the FGM, In this pa-per ,FGM was prepared by plasma spraying , the gradient component was designed and analyzed, and the metallo-graphic structure and microhardness of the gradient coating were tested as well as. The results show that theperformance and life time of the FGM have greater improvement than that of the single materials and the com-posite-level materials. It would have a great effect on development of the industrial technology of our countrythat FGM are applied to modern manufacturing industry and material surface modification.Key words; plasma spraying; FGM; structure design(上接第300页)Synthesis of non-viral gene carrier PEG-PEI and its capability to condense DNALUO Xin'2, PAN Shi-rong' ,FENG Min2 , ZHANG Xuan' , ZHANG Weil ,WEN Yu-ting'(1. The First Affiliated Hospital, SUN Yat sen University, Guangzhou 510080, China;2. School of Pharmaceutical Science, SUN Yat-sen University,Guangzhou 510080, China)Abstract:PEG-PEI graft copolymers were synthesized with IPDI as a coupling reagent, and the copolymers werecharacterized by FT-IR and 'H NMR. The molecular weight of the copolymers were calculated by 'H NMR.The capability of the copolymers to condense DNA was evaluated by agarose gel electrophoresis. It was showedthat the capability of the copolymers to condense DNA was not impaired when grafting 10% and 25% PEG,while the capability was a lttle declined when grafting 50% PE(中国煤化工Key words:non-viral gene crrier; polyethylene glycol; polyethylenC N M H Gte; agarose gel elec-trophoresis

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