烟草中一种糖苷的分离鉴定及其热解产物

烟草科技/Tobacco Science & Technology烟草化学/Tobacco Chemnistry2013年第7期(总第312期)烟草中一种糖苷的分离鉴定及其热解产物周容',冯广林',李东亮",李国友’，戴亚',袁月'1.川渝中烟工业有限责任公司技术中心,成都市锦江区成龙大道一-段56号 6100662.中国科学院成都生物研究所,成都市人民南路四段9号610041摘要:通过95%乙醇提取,常压和高压制备色谱分离,从红花大金元烟叶中提取分离得到化合物I ,利用质谱和核磁共振技术鉴定了化合物I的结构,并在氦气中进行了热裂解-CCMS分析。结果表明:①化合物I为(E)-N-[(4-羟基-3-甲氧基)苯乙基]-3-[(3-甲氧基-4-B-D-吡喃葡萄糖)苯基]丙烯酰胺;②化合物[的热解产物主要是4-乙烯基愈创木酚、愈创木酚、香兰素、对甲基苯酚、2,3-二氢苯并呋喃、4-烯丙基苯酚和3-乙基苯酚。关键词:烟草;糖苷;热解.中图分类号:0629.13文献标识码:A文章 编号: 1002-0861( 2013 )07-0034- 04Isolation and Identification of a New Glycoside in Tobacco and Analysis of its Pyrolytic ProductsZHOU Rong' , FENG Guanglin' , LI Dongliang",LI Guoyou2 ,DAI Ya' , and YUAN Yue'1. Technology Center of China Tobacco Chuanyu Industrial Co.,Ltd., Chengdu 610066,China2. Chengdu Institute of Biology , Chinese Academy of Sciences , Chengdu 610041 ,ChinaAbstract: A new glycoside, (E)-N-(4-hydroxy-3-methoxy)-phenethyI]-(3-methoxy-4-0 B-D-glucopyranosyloxy)phenyl]acrylamide ( I ), was isolated from leaves of flue- cured tobacco cv.“Hongda" through extraction with95% ethanol, preparation at normal and high pressure and separation with chromatography. The molecularstructure of compound ( I ) was identified with HRESI-MS and NMR. Compound (I ) was pyrolyzed in Heatmosphere and its pyrolytic products were analyzed by GC/MS. The results showed that the separated productwas compound ( I ) , and its major pyrolytic products were 4-vinylguaiacol, guaiacol, vanillin, p-cresol, 2,3-dihydrobenzofuran, 4-allylphenol , and m- ethylphenol.Keywords: Tobacco;Glycoside ;Pyrolysis烟草香昧成分一直是烟草行业关注的重点。粗以糖苷形式存在的香料前体物的分子量较大、沸点较苷类化合物是植物在生长过程中形成的次级代谢产高、香气较少或本身没什么香气,但加人卷烟后经过物，卷烟的某些挥发性香味成分就是以糖苷的形式存高温加热或燃烧裂解能均匀释放出具有香味的化合在于烟叶中1.51。以糖苷结合态存在的香味成分有萜物1210]。近年来,与烟草香味有关的糖苷类化合物引烯醇、芳樟醇氧化物、萜烯二醇、萜烯三醇、直链醇和起了烟草科研人员的广泛关注011)。2008年,陈振环状醇，如己醇、苯甲醇、苯乙醇和挥发性酚等「*]。玲 等()报道从津巴布韦烤烟烟叶中提取出3-氧基金项目:国家烟草专卖局2012年科技面上项目“不同地区红花代-a-紫罗兰醇-B-D-吡喃葡萄糖苷,该糖苷的热解大金元烟叶中糖苷类潜香物的研究(0122)四川省科技厅2011产物主要是巨豆三烯酮和3-氧代-a-紫罗 兰醇,有助年重点科技项目“不同地区红大烟叶中糖苷潜香物研究"于改善卷烟烟气的香气质量。1998年， 日本专利公开(201 1JYZ036)。了一种从烟草中分离得到的糖苷化合物一黑麦草内作者简介:周容(1973- -),女.博士，高级工程师、主要从事烟草化学酯β_D-葡萄糖苷,加人卷烟后能与烟香协调,具有使研究。E-mail: zr19730714@yahoo.com.cn; "通讯作者:李东亮香气圆润、加强烟香、抑制刺激和释香持续的效果|4)。E-mail: Lidongliangl63@yahoo.com.cn本研究在对红花大金元(“红大”)烟叶糖苷类化合物收稿日期:2013-01-14的研究中,从烟草中分离得到了一种糖苷一(E)-N-责任编辑:茹呈杰E-mail:rucj69@sina.com，[(4-羟基-3-甲氧基)苯乙基]-3-[(3-甲氧基-4-B-D-电话:0371-6767251334吡喃葡萄糖)苯基]丙烯酰胺( I ):目前，烟草中未见'HNMR和"CNMR:工作频率:各为600和150MHz;内酰胺类糖苷化合物的分离报道，为此进行了烟草中糖标:TMS;溶剂:C.D,N。苷I的提取分离、卷烟中添加评吸及热解实验，以期1.2.3卷烟添加评吸试验为烟草香气评价和卷烟加香提供参考。取12.5mg分离产物,用无水乙醇配制成2.5mg/mL的乙醇溶液;用自动注射加香机注入参比单料烟中，1材料与方法注射量l0μL支;注射后的单料烟在温度(22+1) C和1.1 原料、 试剂与仪器相对湿度(60+2)%条件下平衡48h。对照为注射等量C3F级四川会东红大烟叶;95%乙醇、石油醚(沸无水乙醇，经过相同条件处理的参比单料烟。采用文点为60~ 90C)、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、氯仿(AR,献[15]的方法评吸单料烟样品。四川西陇化工有限公司);DI01型大孔树脂(天津南1.2.4热裂解产物分析开大学树脂有限公司);柱层析用硅胶H(160-200和取1~2 ug分离产物,置于裂解仪中,在氦气氛围200-300目，青岛海洋化工厂);柱层析用反相Cis硅胶中，分别于300, 500, 700和900 C下热裂解,热解产(日本YMC公司);参比单料烟(以2009年重庆丰都物直接通人GC/MS仪中进行分析。分析条件为:K326品种C3F烟叶切丝卷制而成):色谱柱:HP5-MS毛细管填充柱(30mx0.25 mmid. xXRC-1型显微熔点仪(四川大学科学仪器厂,温0. 25 μmd.f);进样口温度:250 C;分流比:20:|;载气:氨度计未校正); Waters 2695 型高效制备液相色谱仪气.1 m/min;程序升温:80心--280 C(5 min);接口温(美国Waters公司);BioTOF-Q质谱仪.BrukerAvance度:250 C;离子源温度:230 C;电离能量:70eV;四极杆600型核磁共振仪(德国Bruker公司);Pyroprobe5000温度:150C;溶剂延迟:2min;扫描范围:35~450amu。裂解仪(美国CDS公司);Clarus 600气相色谱-质谱仪2结果与讨论(美国Perkin Elmer公司) ; AX504电子天平(感量0.000g,瑞士MetterToledo公司);CIECTOR实验室2.1 结构表征自动注射加香仪(瑞士Burghart公司)。该分离产物为白色粉末,熔点: 167~169 C(文献1.2方法[16]报道熔点: 168~170 C)。由高分辨电喷雾质谱1.2.1提取、 分离和纯化(HRESIMS)信号[M+Na]*质荷比528.1846确定其分子取40kg粉碎的红大烟叶.加入400L95%乙醇,升式为CxsH,NOo。'HNMR谱的低场信号显示有8个温到60 C热提取2h,重复提取3次,浓缩,得到8kg氢,其中6个氢:8u 7.50(1H,d,J=8.4 Hz), 7.17(1 H,d,提取物。将提取物水溶后，依次用石油醚.乙酸乙酯J=7.9 Hz), 7.14(1 H,d,J=1.5 Hz), 7.11(1 H,dd,J=8.4,和正丁醇各萃取3次,每种溶剂各用50L。正丁醇萃1.5 H2), 6.98(1 H,d,J=1.5 Hz)和6.90(1 H, dd , J=7.0,取物约2kg。1.5 Hz),其偶合裂分常数表明该化合物结构中含有两将正丁醇萃取物倾入大孔树脂DI01吸附柱(6.5cm个 苯环的ABX三旋体系,剩余的两个氢δ 8.04 (H,x 80 cm),常压下先用20L去离子水洗脱,然后用50Ld,J=15.6 Hz)和6.89(1 H,d,J=15.6 Hz)为典型的反式20%的乙醇洗脱,浓缩洗脱液,得240g褐色液体。将双键烯氢信号,表明该化合物结构中存在一对反式双所得褐色液体加入硅胶层析柱(3.5 cmx 70 cm),氯键烯氢,另外, H NMR谱中83.66(3 H,s)和3.71(3 H,仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(10:1,5:1,3:1.1:1.1:2，s)的峰表明该化合物含有两个甲 氧基。"C NMR谱图各10L),收集氯仿-甲醇(3:1)洗脱液,浓缩,得5g中δc 102.2, 79.2, 78.8, 75.1, 71.5和62.7 ppm 的峰表明样品。将所得样品加人到反相RP-18硅胶柱(2.5cm化合物结构中 含有葡萄糖基团,8c 164.7和42.2 ppm的x 60cm)层析，甲醇-水混合溶剂梯度洗脱( 1:9,2:8,峰表明该化合物含有酰胺基团。3:7,1:1和2:1,各2L),收集甲醇-水(3:7)洗脱液,浓该化合物的'HNMR和"CNMR数据如下:'HNMR缩:浓缩液通人以反相C.为固定相的高压制备液相(CD.N, 600 MHz) :δ 10.75( 1H,s, 4"-0H) , 8.70(1H,柱，40%甲醇作流动相，流速3.0mL/min,收集波长254t,J=6.0 Hz,一NH), 8.04(1H,d,J=15.6 Hz, H-3),7.50nm的流出物，浓缩，即得60mg分离产物。(1H,d,J-8.4 Hz,H-5'), 7.17(1H,d,J=7.9 Hz, H-5"),1.2.2结构鉴定7.14(1H,d,J=1.5 Hz,H-2')，7.11(1H, dd, J=8.4, 1.5用HRESIMS, 'H NMR和"C NMR分别对分离产Hz, H-6'), 6.98(1H,d,=1.5 Hz,H-2"), 6.90( lH, dd,物进行结构鉴定。分析条件为:J=7.9，1.5 Hz,H-6"), 6.89( lH,d,J=15.6 Hz,H-2) , 5.68HRESIMS:喷雾电压:4500V;扫描范围:50-3000amu。( 1H, d,J=7.2 Hz,H-1"), 3.91(2H,m, H-8"),3.71(3H ,35s,-OCH') , 3.66(3H,s, -0CH) , 3.04 (2H, t,J=7.2表2不同温度下糖苷I裂解产物的含量Hz, H-7" );C NMR (CD.N, 150 MHz):8 166.7(C-1)，Tab.2 Pyrolytic products of glycoside I at different149.9(C-4), 149.4(C-3'), 148.9(C-3"), 147.0(C-4"),temperature(%)140.1 (C-3)，131.4(C-1"), 130.3(C-1') , 122.3(C-6')，保留时间匹配度122.3(C-6"), 121.6(C-2)，116.9(C-5') , 116.5(C-5")，_ /min裂解产物19500C700C900C113.6(C-2"), 11.9(C-2'), 102.2(C-1"), 79.2(C-5") ,3.74螺[2.4]-4,6-庚二烯93.3 00.97 4.1978.8(C-3")，75.1 (C-2"), 71.5(C-4") , 62.7(C-6")，6.53苯乙烯91.0 0.34 0.23 1.539.36苯酚87.16.08 11.5556.2 ( -0CH')，56.1 ( -0CH,") , 42.2 (C-8")，36.311.56邻甲苯酚89.6 01.74 3.42(C-7")。 上述各项检测结果与文献[16]一致,确定12.21对甲苯酚92.5 0 12.93 19.62分离产物为(E)-N-[ (4-羟基-3-甲氧基)苯乙13.19愈创木酚90.413.03 6.05 3.46基]-3-[(3-甲氧基-4- B-D-吡喃葡萄糖)苯基]丙烯酰14.933-乙基苯酚94.6 012.58 10.91 .胺(I ,CAS号为119671-93- -0),其结构式见图1。16.872.3-二氢苯并呋喃85.5 (13.45 14.0918.934-烯丙基苯酚HOHH,CO、;器，319.824-乙烯基愈创木酚88.0 74.42 33.22 18.07OCH;H23.39异丁子香酚94.3 1.49 4.42 2.74HO23.47香兰素80.5 10.15 1.18 0.773" H)H图1糖苷I的结构3结论Fig.1 The structure of glycoside I2.2 糖苷I对卷烟感官质量的影响(1)MS和NMR谱结构鉴定证明,通过95%乙醇提评吸结果(表1)表明，与对照相比,添加糖苷1取,常压和高压制备色谱分离，首次从烟叶中分离出一的单料烟样品的香气质量改善,烟气圆润，余味舒种糖苷(E)-N-[(4-羟基-3-甲氧基)苯乙基]-3-适。这说明糖苷I具有提高烟香、圆润烟气和改善余.[(3-甲氧基-4-B-_D-吡喃葡萄糖)苯基]丙烯酰胺。味的效果。(2)该糖苷在氦气中的热解产物主要是具有增加表1添加糖苷I的单料烟样品评吸结果烟草甜香、圆润烟气和改善余味的香气成分一-4-乙Tab.1 Sensory evaluation results of tobacco sample added烯基愈创木酚、愈创木酚、香兰素、对甲基苯酚、2,3-with glycoside I二氢苯并呋喃、4-烯丙基苯酚和3-乙基苯酚。样品评吸结果参考文献对照香气质量较好，烟气较柔和，余味较舒适加糖苷香气质量好,烟气圆润柔和，甜度增加，[1] 黄致喜,金其璋,罗寿根,等,译.香味化学与工艺学[M].余味舒适北京:中国轻工业出版社, 1991 :10-25.2.3热裂解产物[2] DAVIS D L, NIELSEN M T. Tobacco propyro- -glutamicGCIMS分析结果(表2)表明:①在氦气中,糖苷duction[M]. Chemistry and Technology, Oxford, UK:Blackuwell Science , 1999 : 256-284.I的裂解产物主要是4-乙烯基愈创木酚、愈创木酚、香兰素、对甲基苯酚、2,3-二氢苯并呋哺、4-烯丙基[3] Rodgman A. Perfetti T A. The chemical components oftobacco smoke{ M ]. Boca Roton: CRC Press，2009.苯酚、3-乙基苯酚;②在300心糖苷I几乎不发生裂[4] Wahlberg I, Enzell C R. Tobacco isoprenoids [J]. Natural解;当裂解温度上升到500 C时,糖苷I的热裂解产Products Rept , 1987 .4(3):237-276.物主要为4-乙烯基愈创木酚以及少量的愈创木酚和[5] Enzell C R, Wahlberg I. Leaf composition in relation to香兰素;当裂解温度上升到700-900心范围内,其裂smoking quality and aroma[J]. Rcent Adv Tob Sci, 1980.6:解产物的种类比500 C时增多,但部分裂解产物的产64-122.生量有所变化。其中,700~ 900 C范围内,裂解产物[6] 王燕,刘志华。陈永宽.烟草中糖苷类化合物的研究进展.种类增加了对甲基苯酚、3-乙基苯酚.2,3-二氢苯并[J].云南大学学报:自然科学版.2010.2(S1):202-206.呋喃和4- ~烯丙基苯酚;500 C时4-乙烯基愈创木酚的[7] Heckman R A. Dube M F. Lynm D.et al. The role of tobaccopreecursors in cigarette flavor[J]. Res Adv Tob Sci, 1981.7:产生量最高,随着裂解温度的升高,4-乙烯基愈创木107-153.酚、愈创木酚和香兰素的裂解产生量明显降低。(下转第42页)36Gaithersburg. MD，2008 : Number 69 [2012-10-15]. htp://tobacco laminae and stems [J]. Beitr Tabakforsch Int, 1985，webbook. nist.gov/chemistry/.13(1):29-36.[14] 中国烟草科技信息中心。中国烟草科学技术数据库[DB/ [18] Peedin G F. Tobacoproducion, chemistry . and echnology.OL]11 [2012-9-20 ]. htp://sj/ zri.o.c.ncobcooikistijip.Chapter 5 Production Practices. SA. Flue-cured tobacco[ M].[15] Evans R J, Mine T A. Molecular characterizaion of theOxford : Blackwell Science .1999.pyrolysis of biomass. 1. Fundamentals [J]. Energ Fuel,[19] Schlotzhauer W s . Chortyk 0 T. Recent Advances in studies1987. 1(2):123-137.of the pyrosynthesis of cigarette smoke constituents[J]. 」[16] Schmeltz I. Wenger A, Hoffmann D.et al. On the fate ofAnal Appl Pyrolysis . 1987. 12( 3/4):193-222.nicotine during pyrolysis and in a buming cigarette [J]. J[20] Palmer G K. Pearce R C. Tobacco production, chemistry , andAgric Food Chem, 1979 .27 : 602-608.technology. Chapter 5 Production Practices. 5B. Light air-cured[17] Bokelman G H. Ryan Jr w s. Analyses of bright and burleytobacco [ M ]. Oxford: Blackwell Science .199(上接第19页)技.2012(1): 15-16.(3)国外烟草企业在我国申请的加热型无烟气[2] Scienifice Commttee on Emerging and Newly Idenifed烟草制品专利处于优势地位，尤其是在含有可见的烟Health Risks ( SCENIHR). Health Efects of Smokeless草物质的电加热型卷烟领域,已初步形成了较为严密Tobacco Products - Preliminary Report [M]， Press:SCENIHR .2007.的专利布局。(4)近十年间，我国烟草行业在加热型无烟气烟[3] PHILIP MORRIS PROD.电吸烟系统和方法:CN, 1633247[P].2005-06-29.草制品的研究开发方面明显处于弱势地位，在该领域[4]PHILIPMORRISPROD.具有液体存储部分的电加热吸烟的研发重视程度和投人力度都有待加强。系统:CN.102014677A[P]. 2011-04-13.因此.我国烟草行业需要加大无烟气烟草制品的[s」 PHLIP MORRIS PROD. Eereill heae cigrere研发力度,有针对性地研制适合国内消费者需求的多including contolled-release flavoring: EP. 1827146 [P].种无烟气烟草制品，更多地研发和掌握我国无烟气烟2007-09-05.草制品的专利技术，以期在与国外烟草公司无烟气烟6] PHILIP MORRIS PROD. Electrical smoking system: EP草制品市场的竞争中,尤其是国内市场,立于不败之1942754[P]. 2008-07-16.地。[7] PHILIP MORRIS PROD. Smokeless cigarette sysem: EP.1947965[P]. 2008-07-30.参考文献[1] 郑路.近年国外烟草制品设计及研发若干进展[J].烟草科(上接第36页)[12] 李英波，宛晓春,张正竹.烟草糖苷类香气前体研究进展解万翠.糖苷香料前体的合成及其应用研究[D].无锡:江.[J].烟草科技.2006(3):41-43.南大学.2007:30-48.[13] 陈振玲.张浩博,周宛虹，等.姻草中3-氧代-a紫罗兰解万翠,顾小红.阁威,等.糖苷类香料前体的卷烟加香及醇-B-D-吡喃葡萄糖苷的分离鉴定及其热解产物分析[J].缓释效果研究[C]中国烟草学会工业专业委员会烟草化烟草科技.2008(7):28-31.学学术研讨会论文集.海口:中国烟草学会205:50-55.[14]黑麦草内酯B_D-葡萄糖苷及其由该化合物构成的烟草吸.[10] 蔡继宝，李银波,谢卫.等.糖苷合成及其卷烟应用研究食香味改良:JP.1042846[P].1998-02-17.[C//中国烟草学会T业专业委员会烟草化学学术研讨会1s5] YC/T 138-1998 烟草及烟草制品 感官评吸方法[S].论文集.海口:中国烟草学会. 2005:515-520.[16] 相字,李友宾,张健,等.猪毛菜中- -新生物碱[J].药学学.[11]吴新华,朱瑞芝.倪朝敏，等.烟草中糖符类香味前体物质报.2007 .42(6):618-620.研究进展[J].云南化I .2009.36(1):62-65.42