壳聚糖与聚乙二醇交联水凝胶研究

●84●报2010年11月壳聚糖与聚乙二醇交联水凝胶研究赵朋',郑化',邓超”,齐文静',田倩',陈敬华2*(1.武汉理工大学化学工程学院,武汉430070;2.江南大学医药学院,无锡214122)摘要:研兖对壳聚糖(CS)进行化学修饰得到了不同丙烯酰基取代度(1.03%,3.55%和5. 21%)的丙烯酰化羟丙基壳聚糖(AHCS);通过自由基引发反应,AHCS与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)交联得到壳聚糖(CS)与豪乙二醇(PEG)为主体的交联水凝胶。通过SEM观察其为通透性良好的多孔性支架材料。水凝胶的溶胶含量和溶胀度随丙烯酰基取代度的增加而降低,水凝胶中壳聚糖的降解速率也随丙烯酰基取代度的升高而降低。对于同一取代度的交联水凝胶,其在酸性和碱性条件下的溶胀度大于中性环境。细胞试验表明.壳聚糖与豪乙二醇交联水凝胶具有良好的生物相容性.关键词:壳聚糖;聚乙二醇;水凝胶组织损伤或功能缺失是--类严重影响人类健康的疾病,并且医疗费用巨大。目前,治疗这类疾病的临床方法主要包括器官移植、修复手术和医疗器械的使用;但是,这些方法存在诸多问题，例如适宜移植器官的缺乏,长期使用免疫抑制药物造成的副作用,以及移植器官功能的渐行性退化等。组织工程(Tissue Engineering)成为解决这些问题的有效途径。组织工程是指运用生命科学和工程学的原理,体外或者体内构建仿生组织,从而有效替代功能缺失或者受损组织的学科[1~8]。机体组织由两部分组成:细胞及其外环境,后者包括细胞分化和增殖的天然支架一-细胞外基 质(Extracellular matrix, ECM)和各种生物信号分子。组织工程的原理是设计和制备与ECM具有类似性质或功能的生物材料,为细胞的生长提供适宜的环境,促进细胞的分化、增殖及细胞外基质的新生进而再生组织01。适宜的生物材料不仅能够有效地替代ECM,还能够提供生物信号分子的传递系统,从而增强其生物活性,因此研究和开发具有优异理化及生物相容性能的生物材料是组织工程的重要方向0。随着生命科学和材料学的发展,各种生物材料大量应用于组织工程领域,包括电纺丝纤维'0)、纳米复合物门、水凝胶材料[8等。其中水凝胶是一类高含水量的三维网络结构的聚合物,通常由物理/化学交联作用制备。水凝胶以其良好的生物相容性,生物可降解性能，模拟组织的力学性能和ECM的特殊结构，在生物医药组织工程等领域得到了广泛应用0。用于制备水凝胶的高分子分为三类:(1)天然高分子，例如,胶原蛋白,海藻酸钠，透明质酸和壳聚糖等;(2)合成高分子,例如聚乳酸,聚乙烯醇,聚羟基乙酸等;(3)去细胞组织基质等[0]。聚乙二醇(PEG)是一种具有良好生物相容性的水溶性合成高分子,由含PEG嵌段的聚合物行成的水凝胶,其理化性能得到较大的提高。例如,Bryant等1[1]报道,PEG水凝胶的平衡含水量和压缩模量能够影响软骨细胞对ECM糖胺聚糖和II型胶原蛋白的分泌。壳聚糖是一种天然多糖高分子,存在于昆虫,类生物的外壳中,其化学性质类似于植物纤维,由于其与ECM中的糖胺聚糖结构类似,生物相容性良好可以被人体自身分泌的溶菌酶降解而广泛应用于组织工程领域[12]. Ma等["]制备了以壳聚糖,PEG和二甲基丙烯酰胺为基质的可注射型水凝胶,细胞试验表明这种水凝胶具有良好的生物相容性。壳聚糖为水不溶性高分子,本研究首先通过环氧丙烷取代反应制备了壳聚糖的水溶性衍生物羟丙基基金项目:国家自然科学基金资助项目(50873080/E0310);江南大中国煤化工断团队计划项目(JUSRP30905);作者简介:赵朋(1984-).男,硕士研究生.研究方向为生物材料,TelMYHCNMHGcom;"通讯联系人,Email: jhchenwhut@ 126. com.第11期离分子通报85●壳聚糖;在此基础上通过酰胺化反应制备了不同丙烯酰基取代度的丙烯酰化羟丙基壳聚糖。丙烯酰化羟丙基壳聚糖与聚乙二醇二丙烯酸酯发生自由基引发聚合反应,得到以壳聚糖与聚乙二醇为主体的交联水凝胶;研究了丙烯酰化羟丙基壳聚糖的丙烯酰基取代度对水凝胶溶胶含量、溶胀性能、体外降解等性能的影响;并通过细胞试验考察了这一交联水凝胶的生物相容性。1实验1.1 药品壳聚糖(Chitosan,CS) ,分子量150kDa,脱乙酰度90%,化学纯,国药集团化学试剂有限公司;(丙烯酰氧)丙酸(2-CarboxyethyI acrylate) 和聚乙二醇二丙烯酸酯( Polyethylene glycol diacrylate,PEGDA),化学纯,Sigma公司;N=羟基丁二酰亚胺(NHS) ,化学纯,国药集团化学试剂有限公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC) ,化学纯,迈瑞尔化学技术有限公司;N, N, N', N'-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(APS),化学纯,国药集团化学试剂有限公司。1.2丙 烯酰化羟丙基壳聚糖(Acrylated hydroxypropyI chitosan, AHCS)的制备AHCS的合成路线如图1所示:首先制备水溶性羟丙基壳聚糖( Hydroxypropyl chitosan, HCS) ;在此基础上,通过β(丙烯酰氧)丙酸与HCS的自由氨基的酰胺化反应制备得到了丙烯酰化羟丙基壳聚糖(AHCS);通过调控β(丙烯酰氧)丙酸与HCS的投料比率,得到了不同丙烯酰基取代度的AHCS.HCS的制备:1g壳聚糖加入到20mL异丙醇溶液中,机械搅拌2h.加入lmL的30%的氢氧化钠水溶液并继续搅拌5h,- 20C冷冻过夜。 解冻,加入10mL环氧丙烷和1mL的10%四甲基氢氧化铵溶液作为催化剂,缓慢升温至60C ,持续反应8h。反应结束后,过滤得到羟丙基壳聚糖。用去离子水溶解,透析三天除去杂质,冷冻干燥得到羟丙基壳聚糖。AHCS的制备:1g羟丙基壳聚糖溶于20mL水,加入不同摩尔量的F(丙烯酰氧)丙酸,其与羟丙基壳聚糖自由氨基摩尔比为1:10,1*15和1:20.加人与β(丙烯酰氧)丙酸等靡尔量的EDC和NHS作为反应的催化剂。30C,pH=4.0 的条件下搅拌,反应20h,再透析三天,冷冻干燥得到三种不同丙烯酰基(Acryloyl,Ac)取代度的AHCS.HOHGROH2Co-LorHO1ROJNH2」no-EDC.1S .IHnO=CH3R= fcH.CH0H图1 AHCS的合成路线Figure 1 Synthesis route of AHCS1.3 AHCS 的红外光谱表征及取代度的测定把1mg的CS和AHCS样品分别与250mg的溴化钾混合,研细压片后,用红外光谱仪NICOLETNEXUS 470( Thermo Fisher Scientific)测试其红外吸收波诸_400MHz NMR中国煤化工'Spectrometer, Bruker)对HCS与AHCS进行了H NMR波1.4CS与PEG交联水凝胶的制备TYHCNMHG用超纯水溶解PEGDA和不同取代度的AHCS,AHCS与PEGDA的重量比为11,总含量为15%●86.高分子报2010年11月(w/w)。加入引发剂APS和TEMED,最终浓度为20mM。混合均匀后,40°C反应24h。交联完成后,用超纯水浸泡水凝胶24h,每3h换水一次,直至除尽未交联的溶胶。冻干得到CS/PEG交联水凝胶支架。.5 溶胶含量测定未发生交联的高分子以溶胶形式存在于水凝胶网络中,对除去溶胶前后的水凝胶冻干物进行称重，溶胶含量为没有形成凝胶的高分子与高分子总量的比值。相同条件下制备了纯PEG水凝胶作为对照。溶胶百分含量的计算公式为:SC=MuMEmX100%,式中,M。为除去溶胶前水凝胶质量,Mn为除去Mm溶胶后水凝胶的质量。1.6水凝胶支架的微观形态观察以荷兰FEI公司的Quanta200扫描电子显微镜(SEM)观察水凝胶支架的形态,把水凝胶支架的纵切面喷金,在20kV电压下观察其内部结构。1.7水凝胶的溶胀度测定取质量为M的冻干水凝胶支架,置于特定pH值的缓冲液中,37C溶胀24h后,吸去水凝胶表面的水,称取溶胀后质量为M2 ,每个样品测试三次。水凝胶溶胀度(Swelling Ratio,SR)的计算公式为: SR =M:二Mx100%.本研究分别测定了水凝胶支架在pH值为4.00,7.40和9.18的缓冲液中的溶胀度。M1.8水凝胶支架的体外降解性能测试取质量为M的水凝胶支架,置于溶菌酶浓度1mg/mL,pH=7.4的磷酸盐缓冲液中,37C下进行降解。在不同的时间间隔内,将水凝胶支架从溶液中取出,蒸馏水冲洗后冻干,称取降解后的质量为M'.水凝胶支架的降解度(Degradation Ratio,DR)的计算公式为: DR = M-M x 100%。1.9MTT(噻唑兰)法测试水凝胶支架的生物相容性本研究以鼠成纤维细胞L929对CS/PEG水凝胶支架进行了生物相容性测试。细胞株L929由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。首先,将细胞株L929接种于细胞培养瓶中,待细胞长满培养瓶面积约70%时,用0.2%的胰酶溶液消化得到游离细胞L929,并用培养基稀释至5X10*细胞/mL备用。在24孔板中加人300μL的交联溶液,按1.4的方法制备得到CS/PEG水凝胶支架,通过紫外线照射和乙醇浸泡除菌,以PBS溶液充分漂洗除去乙醇。把细胞L929接种在支架表面,接种密度为1. 25X10*细胞/cm2。细胞培养基为含10%灭活胎牛血清,100单位/mL青霉素G和100单位/mL链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM) ,培养条件为37C,5% COr培养箱中培养。分别在培养2、4、8天后,用MTT法对细胞的生长情况进行测定,MTT的最终浓度为1mg/mL,37C反应4h,用2mL二甲基亚砜溶解细胞对噻唑兰的代谢产物甲瓒,在570nm测定其吸光度。2结果与讨论2.1 红外吸收波谱和取代度的测定图2所示为AHCS与CS的红外吸收波谱。其中,CS在3419cm-1处吸收峰为- -OH和一NH对称振动峰;2934和2892cm1处吸收峰为--CH伸缩振动峰;1627cm1和1519cm~'处吸收峰分别为C=O伸缩振动及- CN伸缩振动峰;1416cm~ 1处峰为- -OH和一CH的环变形振动吸收峰;1154cm-'处峰为糖环上伯醇和仲醇吸收峰;1088cm-'处峰为一C-0伸缩振动吸收峰;897cm1处峰为糖环脂肪醛吸收峰。与CS的红外图谱相比,AHCS增加了新的吸收峰,其中,2970cm~'处吸收峰为--CH3伸缩振动峰(羟丙基取代);1710cm-'处峰为-C-CH2弯曲振动吸收峰(丙烯酰基);1456cm~-'处峰为羟丙基上亚甲基-CH2一弯曲振动吸收峰。另外,AHCS新的C-0基团中国煤化工酰基C=0吸收峰(1627cm~')重合;- -CN的吸收峰由1519cm~'转移到I说明CS 的自由CNMH G氨基发生酰胺化反应。红外图谱表明,AHCS相比CS增加:为了计算AHCS的羟丙基取代度和丙烯酰基取代度,对HCS和AHCS进行了H'NMR表征,其图第11期高分子通报87●谱如图3所示;化学位移81.5~2.0区间内的吸收峰归属为羟丙基的- -CH2-氢原子,峰面积与壳聚糖异头碳氢(8为5. 3)的峰面积比值为2. 04,AHCS的羟丙基取代度为2.04/2=1.02(平均每个寡糖单元有1. 02个羟丙基取代基);同样方法计算得到摩尔比为1+10.1:15和1:20条件下,丙烯酰基取代度(C=CH,氢原子化学位移δ为6.5~7.0)依次为1. 03%.3. 55%和5.21%.所得到的水凝胶依次命名为.AHCS1.03-PEG,AHCS3. 55-PEG和AHCS5.21-PEG.1710HCS1814643500 300025002000 1500 1000故敷/cm~1图2 AHCS 与CS的红外吸收波谱Figure2 The FTIR sectrum of AHCS and CSAHCS图3 AHCS与 HCS的H'核磁共振谱Figure 3 The H! NMR' pectrum of AHCS and HCS2.2水凝胶的溶胶含量不同Ac取代度的AHCS与PEG共交联水凝胶的溶胶含量如图4所示。其中,随着Ac取代度的增加,溶胶含量减少,从18.95%碱少至15.42%;交联水凝胶的溶胶含量与纯PEG水凝胶(10.88%)相比增加了约4%~8%。溶胶含量是在交联反应完成后,未形成中国煤化工量的比重。在AHCS PEG的交联体系中,AHCS的可交联双键密度为4.6CNMHG可交联双键巒度为125mM,这表明高分子交联前体的双键密度越高,凝胶的俗胶古重越低。高分子通2010年11月201816! 12-店10AICSI.03PEG AJCS5SP.EC AISS.2I.PEGP图4不同丙烯酰 基取代度的AHCS PEG水凝胶的溶胶含量Figure4 Sol content of AHCS PEG hydrogels with diferent Ac substitution2.3水凝胶支架的微观结构理想的组织工程支架材料不仅需要为细胞的生长分化提供三维空间环境,还需要具有通透性,促进物质在支架与外界环境之间交换,为细胞提供营养及排泄代谢废物。图5所示为AHCS3.55-PEG交联水凝胶的SEM微观形态。从图中可以看出,AHCS3.55-PEG水凝胶是- .种多孔性的支架材料,孔径集中分布在50~200μm,孔与孔之间的通透性良好。CS与PEG交联水凝胶良好的多孔及通透性能够为细胞提供稳定的生长环境,有利于营养物质.信号分子及代谢物质的传递。图5 AHCS3. 55-PEG水凝胶的微观形态Figure 5 Microscopic morphology of AHCS3. 55-PEG hydrogel2.4水凝 胶支架的溶胀度Cs与PEG共交联水凝胶的溶胀性能如图6所示。在相同pH值的溶胀条件下,凝胶的溶胀度随AHCS的取代度升高而降低,例如在pH=4. 00的条件下, AHCS1.03-PEG(8.63) > AHCS3. 55-PEG(6. 56) > AHCS5. 21-PEG(4.38)。而同一种凝胶在不同的pH值条件下溶胀度不同,其中在酸性pH=4.00和碱性pH=9.18环境中的溶胀度大于接近中性的pH=7.40的环境，AHCS3.55-PEG的溶胀度在pH=4.00和9.18的溶胀分别为6. 56和6.29,而在pH=7.40环境下的溶胀度为4.52. CS与PEG共交联水凝胶的溶胀性能主要由AHCS的取代度以及两种高分子的化学组成所决定的。AHCS的取代度升高增加了水凝胶的交联密度和交联度,这一点也与水凝胶的溶胶含量的变化规律相符合;较高的交联度及交联密度增加了水凝胶高分子交联网络的强度以及水中国煤化工=降低了水凝胶的溶胀度。与pH=7.40相比,在pH=4.00的溶胀环境中，发生质子化生成带正电的铵根离子(一NHt),使得壳聚糖的亲水性和分子YHCNMHG=9.18的环境中,PEG链段之间的氢键作用降低。CS与PEG共交联水凝胶的这两种性质使得其高分子网络在pH=第11期高分子通报894.00和9.18的环境中通透性和亲水性增加,而在pH=7.4的环境中,这两种作用都不明显,所以此时的溶胀度最低。10= JAHCSI .03-PEGJAHCS3.55-PEGAHCSS.21-PEG jpH4.00pH 7.40pH9.18图6不同丙烯酰基取代度 的AHCS PEG水凝胶的溶胀度Figure 6 Swelling ratio of AHCS PEG hydrogel with different Ac substitution2.5水凝胶支 架的体外降解曲线壳聚糖能够被存在于体内各组织中的溶菌酶降解[4],并且降解速率与壳聚糖的脱乙酰化程度和壳聚糖的衍生物水溶性有关。本文主要研究了CS与PEG交联水凝胶的体外降解行为以及AHCS的取代度对水凝胶降解行为的影响,结果如图7所示. CS与PEG交联水凝胶的起始降解速率很快,第五天降解速率逐渐降低,而到第10天,降解基本完全。以AHCS3.55-PEG为例,第3.5.10天的降解后剩余质量百分含量依次为78.68%.61.57%和48.78%。随着AHCS取代度的升高,AHCS与PEG共交联水凝胶的降解速率依次减慢。如AHCS1.03-PEG、AHCS3. 55-PEG和AHCS5. 21-PEG在第5天时的剩余质量百分含量依次为53. 87% .61. 57%和70. 34%. AHCS与PEG共交联水凝胶的降解速率主要是由高分子交联网络的结构所决定的,致密的网络结构能够延长壳聚糖的降解时间,这种作用随着AHCS.的取代度增加而增强。●- AHCS1.03-PEG;●- AHCS.55-PEG实9(L工AHCSS.21-PEG已80so-400246810121416182022降解时间/天图7 AHCS-PEG 水凝胶的体外降解曲线Figure 7 In vitro degradaiton of AHCS-PEG hydrogel2.6水凝胶支架的生物相容性本研究以MTT法测试了L929细胞在AHCS1. 03-PEG中国煤化工以空白孔板(表面经处理的聚苯乙烯)作为对照。如图8所示,细胞对MTTYHCNMHG随培养天数的增加而增高,说明L929细胞能够在AHCS1.03-PEG水凝胶支架上生长;在第2.4.8天,AHCS1.03-.●90.高分子通指2010年11月PEG水凝胶支架组的吸光度都比空白对照组高,说明与空白对照组相比,AHCS1.03-PEG水凝胶支架更有利于L929细胞的增殖。以上结果表明,AHCS1. 03-PEG水凝胶支架具有良好的细胞相容性。AHCS1.03-PEG0.87C对照0.7-0.坠0.30.2-0.12培养时间/天图8 AHCS1. 03-PEG水凝胶的细胞相容性测试(MTT法)Figure 8 Cytocompatibility evaluation of AHCS1. 03-PEG bhydroge(MTT assay)3结论(1)通过对壳聚糖进行化学修饰得到了水溶性的AHCS,丙烯酰基取代度为1. 03%,3. 55%和5.21%;在引发剂APS和TEMED浓度为20mM,AHCS与PEGDA的重量比为1:1,总含量为15%(w/w)的条件下交联24h得到CS与PEG交联水凝胶;(2)SEM观察CS与PEG交联水凝胶为通透性良好的多孔支架材料;水凝胶的溶胶含量和溶胀度随丙烯酰基取代度的增高而降低,在酸性或碱性环境的溶胀度大于中性环境;CS与PEG交联水凝胶的降解速率随时间逐渐降低,到第10天降解完全,并且降解速率随丙烯酰基取代度降低而增加;(3)通过细胞试验证明了AHCS1.03-PEG是--种生物相容性良好的水凝胶支架材料。参考文献:[1]刘盛辉,郎美东. 高分子通报20056).113~117.1.[2] Tabata Y.J R Soe Interface,20090 ,6(Suppl 3) ,S311~S324.[3] Langer R.Vacanti J P. 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College of Medicine and Pharmaceutics ,J iangnan Univ ,Wuti 214122 ,China)Abstract:In this study, acrylated hydroxypropyl chitosan ( AHCS) with different substitutiondegree (SD) of acryloyl, ie, 1. 03%，3. 55% and 5. 21%, was prepared by chemical modification ofchitosan (CS). Through free radical initiation reaction， AHCS and polyethylene glycol diacrylate(PEGDA) were crosslinked to form CS-PEG hydrogel. SEM indicated it was a porous scaffold withhigh connection rate. Our results suggested that the sol content (SC) and swelling ratio (SR) of thehydrogels decreased with increase of SD, and SR was higher in acid or alkaline conditions than inneutral condition. While the degradation rate (DR) of chitosan in the hydrogels also decreased withincrease of SD. Cell experiment indicated that chitosan and polyethylene glycol crosslinked hydrogel hadgood biocompatibility.Key words: Chitosan; Polyethylene glycol; Hydrogel中国煤化工MYHCNMHG