石斛多糖提取工艺的研究

实验研究2010年4月第7卷第12期石斛多糖提取工艺的研究陈蕤(广州科技职业技术学院医药营销系,广东广州510550)[摘要]目的:对石斛多糖提取工艺进行优化。方法:比较不同浸提温度时间和除蛋白方法对多糖得率的影响优化工艺。结果:石斛多糖最佳提取工艺条件为90℃水浸提3-4h,料水体积比为1:50,采用 Sevag法脱蛋白,样品- Sevag溶液=1:1、氯仿-正丁醇=10-2.5,提取时间为30min。结论:此方法提取石斛多糖得率高,为理想的提取条件关键词]石斛;多糖;提取工艺[中图分类号]R2842[文献标识码A[文章编号]1673-7210(2010)04(c)-040-03Extraction technology of polysaccharide in DendrobiumCHEN RuiMedical Promotion Profession, Guangzhou Vocational College of Science and Technology, Guangzhou 510550, China[Abstract] Objective: To study optimum extracted -conditions of polysaccharide in Denderobiun. Methods: The mostyield of polysaccharide was gotten which volume ratio of dendrobium to water, distilling temperaturethe and method of iso-lating protein were used. Results: The effects was best when volume ratio of dendrobium to water was 1: 50, distilling at 90C for 3-4 hours, isolating protein by seveg method in the mixture composed of 50% sample and 50% sevag solution, the raio of chloroform and n-butano was 1025, the extraction technology was 30 min. Conclusion: The extraction method is per-fect because the most yield of polysaccharide is gotten[Key words] Dendrobium; Polysaccharide: Extraction technology石斛属植物具有很高的药用价值。而多糖类成分是石斛得率中具有免疫增强作用叫和抗肿瘤作用的活性成分,常以多糖24蛋白去除方法的选择的含量高低来判断石斛药材质量的高低。本研究对石斛多糖本实验运用 Sevag法、TCA法去除石斛多糖中的蛋白的提取工艺进行优化探讨,为其工业化生产和利用提供理论质。241 Sevag法多糖提取液,真空抽滤,浓缩至一定体积,1仪器与试药按比例加入氯仿-正丁醇混合液,剧烈振荡,以5000r/min11仪器的转速离心15min,取上清液。如此反复操作3次。为取得仪器设备有ES204型万分之一天平,电热恒温水浴最佳的实验效果对提取条件设计了正交试验,因素水平锅,RE-52A型旋转蒸发器758B型紫外可见分光光度计。,见表112试药石斛(四川乐山市歇马乡,经成都中医药大学严铸云教豪1Sag法脱蛋自正交设计授鉴定为细茎石斛)洗净杀青后于60℃烘干,粉碎,过50目Tab 1 Factors and their levels of the Sevag method筛备用。本实验所用试剂均为分析纯2方法与结果因素( v aavs2.1提取工艺口s1:110:2520取石斛粗粉约50g,加人石油醚(60-90℃)250ml,回流提取1h,脱脂,过滤,挥干溶剂,加人80%乙醇250ml,回流提取1h,过滤,挥干溶剂加入蒸馏水浸提2次,趁热过滤,242TCA法多糖提取液,以5000mmin的转速离心15min减压浓缩至150m,0.%活性炭脱色,过滤,脱蛋白,加入取上清液加入草酸调整pH至pH=7,加入适量3%的TCA沉95%乙醇使溶液含醇为80%,于冰箱中静置过夜,沉淀物用淀蛋白质调整pH至pH=7放置过夜,以500mmin的转速无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤,烘干,得石斛多糖粗制品。离心15min,取上清液。如此反复操作3次,取平均值。22加水量的选择25极越合的测定方法原料与水体积比分别为1:20、1:30、140、1:50、160,比较中国煤化工含量测定其多糖得率。26结CNMHG23浸提温度的选择26.1不两示体页对们赠多何平的影响见图1。分别在80、85、90、100℃C条件下浸提3~4h,比较其多糖262不同浸提温度对石斛多糖得率的影响见图2。40医药报 CHINA MEDICAL HERALD2010年4月第7卷第12期实验研究3讨论2243.1石斛多糖提取前除杂质22222.0石斛多糖提取前,先用石油醚或乙醚回流提取,可以除去石斛植物中的脂溶性杂质及干扰性色素,而后用80%乙醇回流,除去蛋白质及氨基酸等32石斛多糖浸提时加水量的选择由图1可知,加水量影响石斛多糖得率,随着加水比的增加,石斛多糖的提取率呈上升趋势。若加水比例过少,在没有达到最佳浸提时间之前,浸出液已经变得很少甚至糊锅1:401:501:60从而影响多糖得率。如果加水过多的话,则以后的浓缩过程图1加水量对石斜多糖提取率的影响较繁杂,所以选择原料与水的比例为1:50。Fig 1 Effect on water content on the extraction rate of33石斛多糖浸提温度的确定由图2可知,在90℃条件下浸提3~4h,可达到较多的多糖得率。浸提时,温度过低则导致溶剂的渗透能力和溶剂能力降低,使多糖不能有效溶出,温度过高则使得多糖被破坏,使多糖得率降低。34活性炭脱色多糖成分中会存在一些残留色素,因此需要用活性炭脱色門,加入后应多保留几分钟,使其脱色完全。35多糖提取过程中脱蛋白方法的选择可得知ABC3为最佳组合,即Ⅴ样氯你正丁=1:1、V重:Vgr=10:25、提取时间为30min时效果最佳,多糖得率为75808图2温度对石解多糖提取率的Sevag法脱蛋白的效果好于TCA法粗多糖得率及多糖Fig2 Effect on temperature on the extraction rate of polysaccharide含量均较高,所需时间较短,但 Sevag法也存在着重复多次产生较多有机物质等弊端;而TCA步骤较简单,所用试剂较263 Sevag法脱蛋白的正交试验结果石斛多糖提取过程少,色素物质能在TCA液中随蛋白质沉淀而部分除去,有利中应用Seag法脱蛋白的正交试验结果见表2, Sevag法与于层析精制,但所需时间较长。因此笔者认为采用seagTCA法比较结果见表3。法除去石斛多糖中的蛋白质更为合适。3.6多糖沉淀的分离、洗涤、干燥表2正交试验结果经乙醇沉淀后的多糖可通滤纸过滤、抽滤或者离心沉Tab 2 Results of the orthogon淀等分离得到,滤纸表面粗糙,过滤速度慢,消耗时间多,料C多糖得率(%)在上面的多糖不易洗脱,多糖获得率会因此降低,因此在分20.98离时选用离心沉淀。粗制品烘干前用无水乙醇、乙醚涮洗,可除去多余水分。丙酮需加长洗涤时间、加大用量,尽量除去石2081斛多糖中的色素。粗多糖的干燥可采用自然干燥、高温烘干22233323231等。为实验室操作方便,本实验采用70-80烘干至恒重的2049方法。1968本实验确定石斛多糖最佳提取工艺条件为90℃水浸提1933-4h,料水体积比为1:50,采用 Sevag法脱蛋白样品:氯仿2035正丁醇=1:1(Vv)、氯仿:正丁醇=10:25(V:v)、提取时间为20.191951192230min,粗多糖得率为147%,多糖质量分数为2247%,需要Kz21.262086进一步纯化精制。本结果促进了石斛药材的规模化种植,为19722080药材的工业化生产和利用提供理论基础。参考文献3seag法与TcA法提取结果比较[幅的究云南植物研究1994,16ab3 Companson between Sevag method and TCA method粗多糖得率(%)多糖质量分数(%)Sevag法2247YH中国煤化工CNMHG细胞株生长抑制作用体外死与廾友141-3TCA法1985(下转第43页)CHINA MEDICAL HERALD医药导报412010年4月第7卷第12期·临床研究检验。P<005为有显著性差异。血栓形成增加肾血流量的作用,还能升高血浆清蛋白,双向2结果调节机体免疫功能;稳定缺糖、低氧的心肌细胞膜,保护线粒经治疗后实验组与对照组疗效、住院时间及不良反应比体和溶酶体,增强抗低氧能力,保护心肌细胞;降低心率减较见表1少心肌对氧的需求,又可维持相对高的心率而保证一定的心排出量和冠状动脉流量,以保证心肌供血。上述作用互相依组治疗后疗效比较情况(例附、相辅相成,即中医称为“血以载气,气以运血”的观点。总有效率(%本组中应用中两医结合治疗增加了冠状动脉流量保护实验组958341了急性心肌缺血低氧所致的心肌损伤,维持了细胞膜的完整与对照组比较,P<005性,增加缺血区边缘的毛细血管,有利于侧支循环的建立,加快损伤细胞的修复;改善微循环,抗血小板聚集和血栓形成,表2两组住院时间和不良反应比较(无±s,d)并且能改善血液流变学网。清除自由基包括超氧阴离子和羟组别例数「住院时间不良反应(例)自由基对心肌细胞的损伤;能促进主动脉内皮细胞分泌组织实验组型纤溶酶原激活物,从而提高机体抗凝和纤溶活性,维持血管内血流畅通,使治疗效果大为提高。与对照组比较,P<005由本研究结果可知,中药治疗心肌缺血疗效显著、不良反应少,而且价格低。中西医结合治疗方法对缺血、心肌损伤3讨论起到了积极的保护作用,抑制了心室重构、心肌纤维化的发心脏是一个机械做功的器官,这就决定了它具有高耗生与发展,是治疗心肌缺血的新途径。本研究以中西医结合能、高耗氧、高代谢率的特点。心肌的氧摄取率高达70%,当的方法治疗心肌缺血提高了患者的预后及生活质量。虽然心肌耗氧增加时再提高氧摄取率的潜力很小,需靠扩张冠中医治疗还缺乏统一的诊疗标准但是笔者相信随着临床研状动脉、增加血流量以增加氧的供给。任何造成心脏耗氧增究水平的不断提高在临床与实验的密切配合下,一定会研加和(或)供氧减少的因素都影响心脏做功。心肌有氧氧化的究出治疗心肌缺血的高效、安全的方药,为心肌缺血的治疗能力强而耐低氧能力差。正常情况下,心肌的代谢基本上全开辟新的途径是需氧的明。所以,氧是心肌细胞活动必不可少的物质,而氧参考文献]是通过血液输送给细胞的。心脏没有“氧仓库”,完全依赖心[国际心脏病学会和协会及WHO命名标准化联合专题组缺血性心脏肌血供,一旦缺血,立刻会引起低氧。低氧的直接后果是心肌病命名及诊断标准J中华心血管杂志1981901)75-76细胞有氧代谢减弱,产能减小,使心脏活动时必需的能量供2]陈新谦新编药物学M16版北京人民卫生出版社200380应不足,引起心绞痛、心律失常、心功能下降。近年来临床治因陈灏珠实用内科学M]12版北京人民卫生出版社2051471.疗多倾向于中药和西药相配合据相关研究表明中草药抗心周Kin且,ZmtA, Lofye MT.eta. Postconditioning reduces infarctvia adenosine receptor activation by endogenous adenosine U] Cardiovasc肌缺血效果非常显著,如葛根、丹参、人参、银杏叶等中草药Res200567(1):124133经实验研究证实有抗心肌缺血作用,其所含有效成分部分已5邵耕林传骧现代冠心病北京北京医科大学、中国协和医科大学分离鉴定并用于临床。联合出版社1994258-282本研究中通过中西医结合治疗心肌缺血有效率达细野史郎汉方药理汉方与临床19924743%原因在于丹参的化学成分有抗心绞痛的作用。20世陈玉珍丹渗滴丸合蔗加生脉欣治疗无建状心肌缺血56例长春中纪70年代将丹参注射液及总提取物制成片剂用来治疗心脑图陈旭胡春杰陈日,川芎嗪注射液治疗冠心病心绞痛的临床研究吉血管疾病有良好效果,至今仍为一种常用药在临床使用网。本林中医药2007271)53-54方具有增强心肌收缩力消除体内氧自由基,扩张血管,减少(收稿日期:201001-04)(上接第41页)门王权淳分析数理统计与质量控制北京:人民卫生出版社1991枥云冯卫生孟江等正交试验法优选大枣渣多糖水煎煮提取工艺中药新药与临床药理2003,14(3)200-2028]张西玉三种川产人工栽培石解的多糖含量测定乐山师范学院学4减玉红,牛桂玲李丽娟等滑子菇水溶性多糖提取工艺的研充门食品报2004.195)88-89科技20011115-1819白五静佟丽华香菇多糖提取工艺和含量测定方法研究门黑龙江医5胡雪琼吴红棉郝志明等平菇多糖的提取工艺小湛江海洋大学学药科学200629报,200424(3)656916李瑞赵浩加陈乃林白花蛇舌草多糖除蛋白的方法研究]江苏中医中国煤化工断工老的丸食品与发药,200324(0056-5CNMHG(收稿日期:2001-08)CHINA MEDICAL HERALD即医药醒”43