双菌共发酵餐厨垃圾生产燃料乙醇的新方法

第29卷第5期可再生能源Vol 29 No52011年10月Renewable Energy Resources0ct.2011双菌共发酵餐厨垃圾生产燃料乙醇的新方法奚立民,张昕欣,柯中炉,于红艳,曹树勇(台州职业技术学院生物与化学工程系,浙江台州318000摘要:试验对分离得到的霉菌进行淀粉酶和纤维素酶活性鉴定,获得了一株同时具有淀粉酶和纤维素酶活性的新霉菌。经形态学及分子生物学方法鉴定,初步认定其为一株未被报道过的米根霉,将其命名为 Rhizopusoryzae TZY1。 Rhizopus oryzae TZY与保藏酿酒酵母进行餐厨垃圾共发酵在没有外加任何酶类的条件下发酵后大部分的淀粉及纤维素被利用,发酵乙醇产率与糖化发酵结果大致相等。发酵后经检测,淀粉的利用率在88%以上,纤维素的利用率在84%左右,较之同步糖化发酵,该方法可以部分避免由于酶失活而使乙醇产率降低的问题,并且不需外加糖化酶类,节约了成本,具有良好的产业化应用前景。关键词:共发酵;餐厨垃圾;米根霉;燃料乙醇;乙醇产率中图分类号:TK6;X705文献标志码:A文章编号:1671-5292(2011)05-0084-0The co-fermentation of fuel ethanol produced from kitchengarbage by double strainsXI Li-min, ZHANG Xin-xin, KE Zhong-lu, YU Hong-yan, CAO Shu-yongDepartment of Biology and Chemistry Engineering, Taizhou Vocation Technical College, Taizhou 318000, China)Abstract: A mildew which had the amylase and cellulase activities simultaneously was screenedy activity identification of fungi sample. The result of morphological and molecular identification showed that the strain was a new Rhizopus oryzae(named TZY 1). Rhizopus oryzae tZY1 andaccharomyce scerevisiae were co-inoculated into the kitchen garbage for fuel ethanol fermentation. Without any enzymes addition, most starch and cellulose were consumed after fermentationAccording to the result of detection, the ethanol productivity was approximately equal to the si-multaneous saccharification fermentation (SSF), the utilization of starch was more than 88%, andcellulose was about 84%. Compared with SSF, the method could partly avoid the decrease ofethanol production caused by inactivation of enzymes. For it is relatively simple and inexpensive,the method in the paper provided a good prospect of industrialized applicationKeywords: co-fermentation; kitchen garbage; Rhizopus oryzae; fuel ethanol; ethanol productiv-0引言不适于传统的焚烧、填埋方法处理;由于其含盐量餐厨垃圾是指产生于餐饮经营与居民生活的高,用于做堆肥原料也受到很大的限制叫。因此食物加工下脚料(厨余)和食用残余(泔脚),主要利用餐厨垃圾生产燃料乙醇具有环境保护及可再含有淀粉、纤维素、蛋白质和动植物油等有机质,生能源开发的双重意义。收稿日期:2010-08-12。基金项目:浙江省台州市科研计划项日(08KY13)。作者简介;奚立民(1957-),男,教授,从事有机合成与催化专业技术的研究与教学。E-mil;xilm@Ptzvtc.com中国煤化工CNMHG奚立民,等双茵共发酵餐厨垃媛生产燃料乙醇的新方法餐厨垃圾制备燃料乙醇的基本工艺可以分为合进行共发酵,垃圾中纤维素淀粉两种多糖可同预处理、水解发酵和纯化等4部分。预处理主时被利用,则餐厨垃圾发酵生产乙醇的效率会大要是为了去除垃圾原料中影响水解及发酵的物大提高。质,同时采取一定措施,破坏淀粉、纤维素等多糖据报道,工业上纤维素酶或淀粉酶生产菌主的高级结构,提高后续水解糖化的效率及乙醇发要为霉菌,细菌所产的纤维素酶或淀粉酶一般都酵的产率。水解是将淀粉、纤维素等多糖水解转化存在于胞内或吸附在细胞壁上,不易分泌到培养为可供乙醇发酵的还原糖类国。发酵工艺是采用液中。据此,本试验对分离得到的霉菌,进行淀粉微生物将还原糖类酵解为乙醇;纯化过程主要是酶和纤维素酶活性鉴定,获得了一株同时具有淀通过蒸馏、过滤等手段,获得纯度较高的乙醇粉酶和纤维素酶活性的霉菌。经形态学及分子生在这4部分中,水解和发酵是影响垃圾降解物学方法鉴定,初步认定其为一株未被报道过的效率及乙醇发酵产率的关键步骤,目前主要应用米根霉,将其命名为 Rhizopus oryzae TErI。Rhi的方法为酶水解微生物发酵的生产工艺。此工艺 opus oryzae TZY1与保藏酿酒酵母进行餐厨垃可分为分步水解发酵工艺 (Separate Hydrolysis and圾共发酵,在初步确定的发酵条件下,得到了较好Fermentation,SHF)、同步糖化发酵工艺 Simultane的发酵效果ous Saccharification and Fermentation,SF)两种。1材料与方法同步糖化发酵工艺将水解与发酵同时进行,水解1.1菌种、酶及培养基得到的还原糖同时被微生物利用,避免了水解过111菌种程中由于产物抑制而降低酶解效率的问题,同时酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)TZY0缩短了生产时间,简化了工艺,比分步水解发酵工笔者所在单位保存;米根霉( Rhizopus oryzae)艺更具有实际应用价值。但由于酶活性受环境影T%Y1,本试验筛选鉴定。响较大四,很难保证在发酵全过程中都具有较好1.12培养基的催化水解效果,若要充分利用垃圾中的糖类原富集培养基为麦芽汁液体培养基,采用PDA料,则需要在发酵过程中补加酶类,或者在发酵初培养基分离霉菌,保藏用培养基采用麦芽汁固体期大大提高酶添加量这样会使发酵工艺复杂化,培养基;使用纤维素-刚果红培养基鉴定菌株产同时也提高了发酵成本纤维素酶能力,使用淀粉-无机盐培养基鉴定产某些微生物可以产生相应的水解酶,将其接淀粉酶能力,使用察氏培养基和PDA培养基鉴定入垃圾培养基产生某些水解酶,水解垃圾中淀粉、菌株;采用YFPD液体培养基活化酿酒酵母,采用纤维素等大分子有机物产生还原糖,同时酵母菌PDA液体培养基活化米根酶,采用麦芽汁液体培等乙醇发酵菌种可以快速利用这些还原糖生成乙养基发酵种子培养基間醇,反过来刺激其分解多糖的速度,二者协同作用1.2萬种的分离筛选共同发酵,避免了由于同步糖化发酵工艺中酶活121菌种采集性降低所引发的问题。因此,以混菌共发酵的方法收集酒厂发酵糟及市售小曲样品若干,粉碎来改进同步糖化发酵工艺,可以提高生产效率,降混匀处理后进行富集培养。富集培养物梯度稀释低生产成本。后涂布于分离平板,所得单菌落经过镜检,并接种目前,工业上应用最多的乙醇生产菌为酿酒于斜面试管保藏。酵母,因此已报道的混菌共发酵工艺大多为能产122目的菌株的筛选纤维素酶或淀粉酶的细菌/霉菌与酿酒酵母共发用生理盐水冲洗保藏霉菌斜表面,对获得的酵,利用纤维素或淀粉发酵生产乙醇。直接采用此细胞悬浮液进行梯度稀释,选取合适梯度稀释液方法发酵餐厨垃圾生产燃料乙醇时,垃圾中的纤涂布于纤维素-刚果红培养基表面,于25℃下进维素淀粉两种多糖原料会有一种不被利用,降低行培养;分别用两种鉴定培养基对初步筛选得到了乙醇生产效率,造成资源浪费刚。若将具有淀的既可以产生纤维素酶又可以产生淀粉酶的茵株粉酶和纤维素酶活性的细菌/霉菌与酿酒酵母混进行复筛。中国煤化工.85CNMHG可再生能源2011,29(5)1.23目的菌株的形态鉴定柱;固相支持物为聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-di-将所得的菌株划线接种于察氏和PDA培养 ethylene glycol succinate DEGS);镀膜物为聚酰亚基上,取无菌的盖玻片以45°角插入培养基中,25胺。载气为N2,气化室温度为250℃,柱温为80℃恒温培养,不定期观察菌落、菌丝以及孢子形℃,尾吹为50ml/min;检测器采用氢火焰离子化态,并以魏景超《真菌鉴定手册》为依据,对其进行检测器。以色谱级无水乙醇为标准品,对上述馏出形态学鉴定。液样品进行GC分析,上样量为5μL1.24目的菌株的分子生物学鉴定1.52垃圾原液及发酵液组分的检测采用CTAB法提取该菌总DNA,以所得到的采用比色一分光光度法方法测定垃圾原料及总DNA作为模板,依 Takara Fungi identi-- fication发酵液中可溶性糖——还原糖含量;采用GBPCR Kil进行26 SrDNA DI/D2区域扩增。扩增完T50099-2003所列方法测定淀粉含量;采用GB成后,取其2μL在1%的琼脂糖凝胶上作电泳检05009-10所列方法测定纤维素含量。查,其余PCR扩增产物用UNQ-10柱式PCR产2结果与分析物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限2.1菌种的分离筛选公司产)回收纯化,并由该公司进行序列测定。经初步分离,从酒药酒曲样品中共获得5株1.3餐厨垃圾的预处理疑似为霉菌的菌株。将5株霉菌分别稀释涂布在首先将收集的餐厨垃圾进行人工分拣,拣出纤维素刚果红培养基上培养,两天后观察其透明如大块骨头等体积较大的块状物及金属物、塑料圈的产生情况,计算其相对酶活力,结果见表1。等不能做发酵原材料使用的物质;然后将垃圾打表1纤维素分解菌相对酶活力的测定浆粉碎,并加入5%的氨水进行超声处理,对纤维Tablel Detection of relative cellulase activities by cellulose-decomposing fungi素进行破晶处理。处理后的垃圾添加3倍体积的编号CMC酶相对活性A′/cmd水进行高温灭菌,即作为乙醇发酵培养基,pH为0.355±0.5自然值0433±0.314酿酒酵母与米根霉共发酵餐厨垃圾酿酒酵母菌株单克隆接人50 mL YEPD液体,培养活化24h;按10%的接种量接入麦芽汁″A=溶解圈直径/菌体培养时间种子培养基培养24h,以获得酿酒酵母种子。无菌将所得的3株具有纤维素酶活性的霉菌稀释水冲洗米根霉斜面培养物获得孢子悬浮液,血球涂布于淀粉-无机盐培养基上进行淀粉酶产生能计数板对悬浮液中的孢子进行计数,在悬浮液中力鉴定,只有3号菌(表1)产生了明显的淀粉水加入无菌水调整每毫升悬浮液中孢子的数目为解透明圈,淀粉透明圈直径与菌落直径比值为106个,取5mL孢子悬浮液接入50 mLPDA液体(251±04),将其具有纤维素酶活性和淀粉酶活培养基活化培养24h;按10%的接种量接入麦芽性的菌株初步命名为TZY1l汁种子培养基培养24h,以获得米根霉种子。以发2.2菌株TzY1的鉴定酵原液作为培养基,接入一定比例的酿酒酵母种经察氏和PDA培养基培养观察发现:TZY1子和米根霉种子,在25r/min条件下培养进行乙菌落稠密,最初呈白色,后变为褐色(图1a)。菌丝醇发酵。匍匐爬行,无色;假根发达,分枝呈根状;孢囊梗直1.5分析方法立多分支,与假根对生(图1b);囊轴为卵圆形、淡1.5.1乙醇提纯与检测褐色;孢子囊近似球形,孢囊孢子呈椭圆形、黄灰发酵液以5000r/min离心10min,取出上清色(图1c)。液后,控制温度为85~90℃,蒸馏30min,气相色测序结果表明,TZY1的26 S rDNA DI/D2区谱检测馏出液中乙醇的浓度及其他组分含量。气域扩增共得到575bp的核苷酸序列,将得到的序相色谱分析按如下条件进行:仪器为FUL9790列在NCB数据库中作 BLAST分析,发现其与Ⅱ气相色谱仪,0.32mm×30mm弹性石英毛细管 Rhizopus oryzae strain WWFP84628 ribosomal中国煤化工CNMHG奚立民,等双菌共发酵餐厨垃圾生产燃料乙醇的新方法(a)在PDA固体培养基上(b)显微镜下的(c)显微镜下的孢子囊、培养的菌落形态菌丝、孢囊梗孢囊孢子图1菌株TZY1形态鉴定结果Fig. I Morphological identification of TZYlRNa gene序列的相似度最高,为99%。利用菌共发酵餐厨垃圾生成燃料乙醇的工艺路线。ClustalX软件构建其系统进化树(图2),由图2可知TY1与 Rhizopus oryzae及 Rhizopus homothallicus形成一个类群,其序列同源性最高。结10-7.5%合形态学鉴定结果,初步判定TZY1为一种未报道过的米根霉( Rhizopus Oryzae tZY)。88-×-12%未命名毛毒( M. armphibionum雅纹鳞质霉(A. elegans)8421000时间h(a)不同TZY1l接种量发酵液中乙醇产率随时间变化情况华是胜枝莓(H, pulchrum)为异常倚囊霉( Anomala)4%为莫勒接霜( Zoeller)冻土毛霉( M hiemalis)图2基于26 SeDNA序列和 Neighbor- Joining法构建一米一15%的系统进化树Fig 2 Phylogenetic tree of TZTI, based on 26s rDNAsequence and Neighbor-Joining method2、3酿酒酵母与米根霉共发酵餐厨垃圾生成乙醇时间h在乙醇发酵培养基中接入15%的酿酒酵母(b)不同TzY1接种量发酵液中还原糖残留量种子,同时接人不同比例的米根霉种子,在28℃随时间变化的情况下进行乙醇发酵,检测发酵液乙醇的产量及还原图3不同TzY1接种量发酵液中乙醇的产率及还原糖糖残留量随时间变化的情况(图3)的残留量随时间变化的情况从图3a可见,在不添加淀粉酶及纤维素酶的Fig 3 Ethanol productivity and residue of reducing sugalong with time in different incubation amount of TZY1情况下,当米根霉的接种量为75%~12%,发酵72为检验大分子多糖在发酵过程中被利用的h后,乙醇的产率达到最高(1lmL∥100mL左右),情况,按上述条件进行餐厨垃圾乙醇发酵,以发与前期试验中所得的同步糖化发酵乙醇的产率酵培养基中只接入15%的酿酒酵母种子及不进大致相同。米根霉的接种量超过75%时,对基质行任何微生物接种的空白发酵培养基作为对照,中还原糖的消耗量2h后几乎达到了最大(图同时进行发酵,发酵后比较发酵液还原糖、总糖、3b)。因此,15%酿酒酵母接种量,7.5%TXY1接种淀粉及纤维素残留量,结果如图4所示。在接入量,28℃,25rmin发酵72h是一条初步可行的双75%的TZYl的情况下(1号),发酵液中的淀粉及中国煤化工87CNMHG可再生能源2011,29(5)纤维素都得到了利用,虽然发酵后淀粉及纤维素DA KHRAISHEH. Bioconversion of municipal solid都有一定的残留(淀粉11%左右,纤维素15%左waste to glucose for bio-ethanol Production[J].Biopro-右),但残留量较低。如再经过工艺改进,可以获cess Biosyst Eng, 2007, 30(3): 189-196得更高的乙醇产率及更低的多糖残留率。[4 WANG QUNHUI, NARITA JUN-YA, XIE WEIMINet al. Effects of anaerobic/aerobic incubation and stor5口还原糖age temperature on preservation and deodorization of24口总糖kitchen garbage [J]. Bioresource Technology, 2002, 84□淀粉(3):213-220纤维素[5 TOSHIYUKI MURAL, TOMOKO YOSHINO, MIT-SUYOSHI UEDA. ef aL. Evaluation of the function arm-ing yeast displaying glucoamylase on its cell surface bydirect fermentation of corn to ethanol[].Journal of Fer-mentation and Bioengineering, 1998, 86(6): 569-572图4发酵后发酵液中还原糖、总糖、淀粉及纤维素残留量[6] ELIA TOMAS -PEJO, JOSE M OLIVA, MERCEDESFig 4 Residue of reducing sugar, total sugarBALLESTEROS, et al. Comparison of SHF and SSFstarch and celluloseprocesses from steam -exploded wheat straw for ethanol1-15%的酿酒酵母接种量,7.5%的TZY1接种量发酵;2-只production by xylose-fermenting and robust glucose人15%的酿酒酵母种子发酵;3-不进行任何微生物接种发酵fermenting saccharomyces cerevisiae strains [Biotechnology and bioengineering, 2008, 100(6): 1122-1131讨论[7 HANNE R SORENSEN, SVEN PEDERSEN. Efficiencies(1)本试验新筛得一株具有淀粉酶及纤维素of designed enzyme combinations in releasing arabinose酶活性的米根霉菌株( R Oryzae)TzY1,将其与酿and xylose from wheat arabinoxylan in an industrial酒酵母一同接入餐厨垃圾进行乙醇发酵,乙醇的ethanol fermentation residue[J]. Enzyme and Microbial产率与同步糖化发酵大致相等。经检测,发酵后Technology,2005,36(5):773-784淀粉的利用率在88%以上,纤维素的利用率在8 JORGEN SAUER, BENT W SIGURSKJOLD.ULA84%左右,工艺简单,节约成木,具有良好的产业CHRISTENSEN, et al Glucoamylase: structure/function化应用的前途。relationships, and protein engineering[J]. Biochim Bio-(2)本试验中酿酒酵母的接种量、发酵温度、[9] GOPAL KEDIA, RUOHANG WANG, HEMANT PATELH以及同步糖化发酵的检测结果均由前期试验et al. Use of mixed cultures for the fermentation of cere-结果比较得出,具体试验过程本文未列出。(3)与其他餐厨垃圾乙醇发酵不同,本试验Process[J]. Biochemistry, 2007, 42(1): 65-70选择了低浓度培养基(3倍体积的水)的发酵条件10 HARUHIKO YOKIO, AKIO SAITSU, HIROYUK1进行发酵,底物利用充分、反应完全。酿酒酵母具UCHIDA, et al. Microbial hydrogen production from有一定的乙醇耐受度,低浓度发酵不易引起由于sweet potato starch residue[J].Joural of Bioscience and乙醇浓度升高而引起的酿酒酵母活力降低乃至Bioengineering, 2001, 91(1): 58-63死亡的现象。[11J KRISZTINA KOVACS, GEORGE SZAKACS, GUIDOZACCHI Comparative enzymatic hydrolysis of pretreated参考文献spruce by supernatants, whole fermentation broths and[1] MURPHY J D, MCCARTHY K Ethanol production fromwashed mycelia of Trichoderma reesei and Trichodermaenergy crops and wastes for use assport fuel inatroviride [J]. Bioresource Technology, 2009, 100(3):Ireland J). Applied Energy, 2005, 82(2):148-1661350-1357.[2] YAN LIN, SHUZO TANAKA. Ethanol fermentation from[12]沈萍,范秀容,李广武微生物学实验(第3版川M北biomass resources: current state and prospects JI.Appl京:高等教育出版社,200249-77Microbiol Biotechnol, 2006, 69(6):627-642[3]杜连祥工业微生物实验技术M]天津:天津科学技术3] AIDUAN LI, BLANCA ANTIZAR-LADISLAO, MAJE出版社,199232-50中国煤化工CNMHG