聚乙二醇对矮丛越橘愈伤组织抗逆性的影响

吉林农业大学学报2009,31(5):538 ~ 542http :// xuebao . jlau. edu . cnJournal of Jjilin Agricultural UniversityE-mail : jindxb @ vip . sina . com聚乙二醇对矮丛越橘愈伤组织抗逆性的影响孙月明，张志东”，李亚东，吴林，刘海广吉林农业大学园艺学院，长春130118 .摘要:以矮丛越橘“芝妮"(Chignecto)."芬蒂"(Fundj)为试验试材。研究了不同质量浓度聚乙二醇(PEG)胁迫培养对越橘愈伤组织抗逆性的影响。结果发现越橘愈伤组织内SOD和CAT酶活性随着胁迫培养时间延长呈现先开高后降低的变化趋势,在100g/L处理第6d时，“芝妮”和“芬蒂”的SOD活性值最高分别为1 991.9,2 483.1 U/g,CAT活性分别为12.2.11.69 U/(g'min)。2个品种愈伤组织的POD活性、.MDA与脯氨酸(Pro)含.量均随处理浓度增加及处理时间的延长星开高趋势。关键词:越橘;聚乙二醉;愈伤组织;抗逆性.中图分类号: S663.9文献标识码: A文章编号: 100-0684(2009)05-0538-05Effect of PEG Stress on Resistance of Lowbush Blueberry CallusSUN Yue-ming, ZHANG Zhi-dong, L Ya-dong, WU Lin, LIU Hai-guangCollege of Horticulture，Jilin Agricultural University, Changchun 130118, ChinaAbstract: The ffect of PEG stress in different concentrations and different stress culture time on blueber-ny callus (lowbush blueberry , Chignecto and Fundy, as experimental samples) was studied. The resultshowed that the trend of diversity of SOD and CAT goes to conformity, which is increased at the first stageand then decreased. When the samples were treated with 100 g/L on the 6th day, the activity values ofSOD of Chignecto and Fundi were respectively 1 991.9 U/g and 2483.1 U/g, the values of CAT wererespectively 12.2 U/(g* min)and 11 .69 U/(g* min). The activity of POD and content of MDA and Prorose up continuously in different time spans and concentrations .Key words: bluebemy; PEG; callus; resistance越橘为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccini-标变化规律,旨在为进一步利用PEG开展越橘抗um)小浆果类果树,是20世纪发展起来经济价值性诱变育种提供依据。很高的新兴优良果树。越橘是浅根系植物，没有.1材料与方法根毛,其根系集中分布在10~ 30 cm的土层。干旱胁迫对越橘生长结果影响很大。此外,越橘枝1.1 试验材料条越冬能力较差,在黑龙江、吉林、辽宁等地区人.供试材料选择矮丛品种群的“芝妮"(Chignec-工裁培时必须埋土防寒才能保证枝条安全越冬。.to)和“芬蒂"( Fundy) ,均取自吉林农业大学小浆果聚乙二醇( polyethylene glycol, PEG)常 用做植物耐研兖所。旱性选择剂或水分胁迫剂。1973 年, Heydecker最1.2 试验设计与方法早成功利用PEG处理蔬菜种子1],此后PEG的渗1.2.1培养基及培养条件采 用WPM( Wod透处理应用于多种作物上且效果显著[251。本试Plant Medium)为基本培养基。除了PEG(北京鼎验用PEG处理越橘愈伤组织,探讨其抗性生理指国生物试剂公司)胁迫时采用液体培养基外,其余中国煤化工基金项目:公益性行业(农业)科研专项(nyhya 07-028. 2006- C25),吉林作者简介:孙月明,女,硕士研究生.主要从事果树生物技术研究。.MYHCNMHG收稿日期: 2008-12-20 。修回日期: 2009-02-28通讯作者孙月明等:聚乙二醇对矮丛越橘愈伤组织抗逆性的影响539培养均采用固体培养基,添加琼脂5 g/L,蔗 糖用茚三酮显色法(6]测出在515 nm下样品的吸光30 g/L,pH 5.4。培养基在121C,1.1 Kg/cm2 压度,计算Pro 含量。力下高温灭菌20 min。培养温度为(23 +2)C,光2结果与分析照强度为2 000 x,光周期为16 h光照/8 h黑暗。选用PC材质.直径为8 cm的培养瓶。PEG 胁迫2.1 PEG 对愈伤组织SOD活性的影响培养时采用非透气盖,其余培养采用透气盖。由图1和图2可以看出，随着处理时间的延1.2.2 愈伤组织的诱导 从田间健壮植株上采长，两个品种愈伤组织内SOD活性值均呈现先升集幼嫩新梢,表面消毒后接种在增殖培养基高后降低趋势。200 g/L处理较短时间内SOD的(WPM+ZT 0.5 mg/L)上。继代后再用增殖培养活性就达到很高的水平,但是随着处理时间延长基培养6周左右。取距组培苗基部约5 cm处新其活性下降明显,在第8 d时低于50 g/L处理相梢的叶片,用解剖刀在叶片远轴面中脉处横切几对应的SOD活性值。这说明在轻度和中度胁迫刀,但不要切断叶片。将刀口朝上平铺在愈伤组时SOD的活性得到很明显的提高,并且提高幅度织诱导培养基(WPM +2, 4-D 1.0 mg/L)上。约很大,但是在重度胁迫时由于自由基积累量增大,10d出现愈伤组织。20d后将产生愈伤组织的叶愈伤组织逐渐不能抵御负离子的伤害,SOD活性片转移到愈伤继代培养基(WPM + CPPU逐渐降低。100g/L处理6d时,“芝妮”与“芬蒂"2.0mg/L)上。以后每20d将愈伤组织继代1次。的SOD活性均达到最高，分别为1991.9,1.2.3 PEC 胁迫方法用第 3次继代的愈伤组2 483.1 U/g。织作为试验材料进行胁迫培养。将愈伤组织块接2500种在PEG质量浓度分别为0,50, 100, 150,200 g/L2000的液体继代培养基(WPM + CPPU 2.0 mg/L)中。1500 |在培养瓶中放置3张滤纸,加人液体培养基30 mL,用非透气瓶盖封口后高压灭菌。每个瓶内1000接种6块直径约3cm、生长旺盛的愈伤组织,每个500处理10瓶。胁迫处理时间设2,4,6,8 d4个水平。胁迫结束后将愈伤组织取出后测定其脯氨酸(Pro)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物歧化酶t1d+ 50g/;+ -100gL:+150g/L:￥200g/L(POD)、过氧化氢酶( CAT)及丙二醛(MDA)含量或活性。图1 PEG处理后“芝妮"愈伤组织SOD活性变化1.2.4测定方法取0.5g胁迫处理后的愈伤.Fig.1. The altration of SOD actity of Chignecto with组织,加少量石英砂和少许磷酸缓冲溶液研磨至.PEG treatment3000匀浆,用磷酸缓冲溶液定容至20 mL。1 000 r/ min离心20min。记录离心后的液体体积。冰浴保-2500存,用于SOD、CAT、POD、MDA的测定。2 2000~取样液0.05 mL,采用NBT光化学还原法[6]B 1500测定SOD活性;取样液0.2 mL,采用比色法[6]测谷s:定CAT活性;取样液1 mL,采用愈创木酚法[6)测定POD活性;取样液5mL,采用硫代巴比妥酸(TAB)法[6]测定MDA含量。称取愈伤组织0.3 g,加入80%酒精研磨,再+ 50g/:+100g/L: +l50gr * 200肌用1mL80%酒精冲洗研钵3次。将液体合并转.圈2 PEG 处理后“芬蒂"愈伤组织SoD活性变化移到离心管中,在80恒温水浴锅中提取20min。中国煤化工1 of Fundy with再向离心管中加人少许活性炭和人造沸石,振荡YHCNMHG5 min,4 000 r/min离心10 min,取上清液备用。利.吉林农业大学学报Joumal of Jilin Agricultural Unirersity540吉林农业大学学报2009年 10月2.2PEG对愈伤组织CAT活性的影响的积累量少,导致POD活性有所下降。POD 的变.“芝妮”与“芬蒂”经不同质量浓度PEG处理化趋势与SOD和CAT不同,这可能是由于POD后CAT活性的变化趋势与SOD的趋势大致相同，也可 在逆境或衰老后期表达,参与活性氧的生成，整体呈现先升高后下降趋势。由图3可以看出,表现为伤害效应，是植物体衰老到一定阶段的产“芝妮"在PEG浓度为150g/L时,CAT的活性明物。显要高于其他处理,但是在处理后第6d 100 g/L处理的CAT活性超过150g/L处理,达到最高值Xi 120012.2 U/(g*min)。“芬蒂”愈伤组织内的CAT(图4)50g/L处理第6d和第8dCAT活性均高于200g/L处理,这与SOD的变化趋势不相同,这可能是由于200 g/L处理浓度过高抑制了CAT酶活00年4r2-十50g/L:+ -100g/L:+l50g/L:￥200 g/L8$围5 PEG 处理“芝妮"愈伤组织POD活性变化Fig.5. The alteration of POD activity of Chignecto withPEG treatmentx14001200)00t1d800+ 50g/L:+-100g/L:+-150g/L:-￥- 200g/L600 I圈3 PEG 处理后“芝妮”愈伤组织CAT活性变化400Fig.3. The ateration of CAT activity of Chignecto with2004「t/d+ 50g/L:+100g/L;→l50gL:-*- 200g/L圈6.PEG处理后“芬蒂"愈伤组织POD活性变化Fig.6. The alteration of POD actity of Fundy with2.4 PEG对愈伤组织MDA含量的影响MDA是植物受到外界胁迫时产生的一种衰老产物。由图7、图8可见,愈伤组织中MDA含量+ 50gL:+ -100gL:+l50g:- * 200gyL均随处理时间的延长不断升高。2个品种50 g/L图4. PEG处理后"芬蒂”愈伤组织CAT活性变化处理MDA含量随时间上升速度均不大,100g/LFig.4. The ateration of CAT activity of Fundy with和150g/L处理上升速度有所加快但仍比较稳定,200 g/L处理第8d MDA含量明显增加，“芝妮”达2.3PEG对愈伤组织POD活性的影响到0.086 umol/L,“芬蒂"达到0.092 pμmol/L,较.由图5和图6可以看出，2个品种的POD活.50g/L处理第2 d分别增加了29.6 倍和46倍。性均随着PEC处理浓度加大和处理时间的延长这说明200g/L处理第8 d时植物膜透性已经明而不断升高。但由图6中可以看出，“芬蒂"在显被中国煤化工150 g/L处理第6d时POD活性值出现小幅下降,可能是由于此处理SoD与CAT相对较高, H2O2TYHCNMHGJoumal of Jilin Agricultural University 2009，October孙月明等:聚乙二醇对矮丛越橘愈伤组织抗逆性的影响5410.10 r增加4倍。有研究证明Pro的积累是一种可遗传0.08 t积累,同时Pro含量的增加利于提高植物抗性。0.060.0412000.02*80040t/d十+ 50g:+100gL;+ 150gLr * 200g/L围7PEG处理的芝妮越橘愈伤组织MDA活性变化/dFig.7. The ateration of MDA activity of Chignecto with+50g/L;+100g/L:-←150g/L;￥- 200gLPEG treatment围10 PEG 处理后“芬蒂"愈伤组织Pro含量变化.10Fig. 10. The alteration of Pro activity of Fundy with0.083讨论有研究表明,在PEG的胁迫下植物体内SOD0.02活性得到显著提高,这是由于PEG对植物细胞造成了水分胁迫,从而产生大量的自由基,引起SOD酶活性大幅度的提高,以减轻自由基对植物细胞+ - 50g/L:+ -00g:+ 150g/:- * 200gyL的伤害。但是胁迫程度超过植物细胞所能调节的围8PEG处理的芬蒂越橘愈伤组织MDA活性变化范围,SOD活性下降。毛淑蕊[7|利用PEG6000鉴Fig.8. The ateration of MDA activity of Fundy with定花生抗旱性,结果显示随着PEC浓度的升高,2.个品种试管苗的SOD活性均呈先升高后下降的2.5 PEG对愈伤组织Pro的影响由图9和图10看出,随着处理浓度的增大及趋势。许桂芳[8]在PEG胁迫对2种过路黄抗性处理时间的延长,两品种愈伤组织内的Pro含量生理生化指标的影响的研究中发现,SOD活性得到明显提高。本试验验结果与毛淑蕊的研究一均呈大幅上升趋势。致,即随着PEG胁迫浓度的升高,愈伤组织的1600SOD活性呈先升高后下降的趋势。本试验结果与许桂芳研究结果不一致,其原因可能是由于试验材料不同。CAT 活性的变化趋势与SOD相一致,因为CAT的主要功能是清除在SOD催化条件下产生的H202。400POD是植物体内普遍存在的、活性较高的一05种酶,它与呼吸作用光合作用及生长素的氧化等1/d有密切关系。在植物生长发育过程中POD的活+ 50g[:+-100g/L:- + 150g/:- * 200g/L性不断发生变化,因此研究其活性变化可以反映團9 PEG 处理后“芝妮"愈伤组织Pro含量变化某一时期植物体内代谢的变化。本试验中在初期Fig.9. The ateration of Pro activity of Chignecto with轻度和中度胁迫时POD增多的原因是由于逆境条件中国煤化工户细胞。但是随如“芬蒂”200 g/L处理8d时Pro 含量达到胁迫MHCNMHG:植物衰老的产1 698.8 r/g,比50g/L处理2 d时的416.8 prg/g物。争水强认为rUU的土安作用是作为衰老吉林农业大学学报Joumal of Jilin Agriculural University542吉林农业大学学报 2009年 10月的产物而存在。巩振辉[10]等人在研究人工老化研究[].种子, 1998. 17 (3): 1-14.和PEG引发对甜椒种子活力及芽期过氧化物酶4] 孙耀中,李兰芬,许滨莲. PEC渗透调节对小麦种子活力的影晌[J].河北农业技术师范学院学报，1995, 9(4): 71-74.活性的影响时发现，PEC引发能逆转老化作用,5] 洪法水,王旭明，马成仓。PEG预处理提高长米种子活力和提高种子活力和芽期过氧化物酶活性。刘志刚等萌发代谢的效应[J].安徽农业科学，1995. 23 (2): 111人叫在研究PEG对芦笋的影响时也得到相同的113.结果。本试验中越橘愈伤组织内的POD活性随6] 张治安,张美善,蔚荣海.植物生理实验指导[M] .北京:中国.胁迫程度的加大而升高,这与前人研究结果-一致。7] 毛淑蕊.利用pEC6000离体鉴定花生抗早性技术体系的研农业科学技术出版社.004:132-140.MDA是膜脂过氧化作用的最终分解产物,其究[D].山东农业大学2008.含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。在PEC8] 许桂芳.PEC胁迫对2种过路黄抗性生理生化指标的影响的胁迫过程中越橘愈伤组织内MDA含量一直呈[].草业学报，2008,17 (1):66-70.上升趋势,这与戴高兴等人对小麦的研究结果相9] 尹永强,胡建斌,邓明军植物叶片抗氧化系统及其对逆境同[12]。轻度胁迫与较高浓度胁迫相比较,MDA的胁迫的响应研究进展[J].中国农学通报,2007, 23 (1): 105- .109.积累速度要慢。这样说明在较高浓度胁迫下,愈[10] 巩振辉,何玉科,周新民.陈启林.人工老化和PEG引发对伤组织中的自由基随SOD的活性下降而大量积甜椒种子活力及芽期过氧化物酶活性的影响[].河南职累,导致MDA含量的大幅上升。技师院学报.192.20 (4):50.56.植物细胞缺水时Pro含量增加。Pro含量在.[11] 李志刚,刘威.林彰文,顾继光.芦笋在PEG模撒干旱条件- -定程度上反映了植株体内的水分情况,因而可下的生理生化变化[J].生态科学，2006,25<1):21-24.以作为植物缺水状况的参考性生理指标。Pro 作[12] 戴高兴,彭克勤,箫浪涛. 邓国富聚乙二醇模拟于旱对耐为植物蛋白的组成部分,当植物细胞受到胁迫时，低钾水稻幼苗内二醛、胸氨酸含最和超氧化物歧化酶活性的影啊[J].中国水稻科学200620<5)55.559.会大量积累。在干旱和模拟干旱胁迫下,蚕豆和[13] 鲍思伟,谈锋,廖志华.土壤干旱对蚕豆叶片渗透调节能力野生大豆的游离脯氨酸明显积累(13.141。关于脯的影响[J].西南农业大学学报,2001.23(4):353.359.氨酸含量在逆境下产生积累的生理效应有许多不[14] 张美云,钱吉,郑师章.渗透胁迫下野生大豆游离脯氨酸和同的观点[15-16]。有学者认为Pro含量叮作为抗旱可溶性糖的变化[J].复旦学报,2001 ,40(5) :8-561.的指标[16],或者是伤害程度的指标|7],而刘娥娥[1S]马国良,李军乔.李炳发.渗透胁迫对克隆植物旅麻游离脯等[18)认为Pro含量应该作为胁迫敏感指标。本试氨酸含量的影响[J].青海师范大学学报:自然科学版，2005. 6(3) :76-77.验中Pro在PEG的胁迫下得到很高积累,可以作[16]卢少石,陈斯萍 ,陈斯曼,等.3种暖季型草坪草在干旱条件为胁迫敏感指标。下晡氨酸含最和抗氧化酶活性的变化[J].园艺学报.2003.30(3):303-306.参考文献:[17] Hanson A D, Nelon C F.Peersen A R,et al .Capacity for pralineaccumulation during water stres in barley and itso implication for[1] 张燕,方力,李大飞,等.聚乙二醇对烟草种子活力及幼苗breeding for drought reistance[]. Crop Sei, 1979, 19:489-493保护酶活性的影响[J].云南农业大学学报，2004，19 (1):[18] Liu J,Zhu J K. Proline sccumulation and salteerindue gene36- 40expression in a sl-hypersensitive mutant of Arabidopais[J]. Plant[2] 刘宇,王萍娟,李天昊,等.聚乙二醇渗透处理对膜荚黄芪Physiol, 19911191.5196种子发芽及幼苗抗冷耆的影响[J].吉林农业大学学报，[19]刘娘娥,宗会,郭振飞,等.干旱、盐和低温胁迫对水稻幼苗2007 .29(1):61.64.脯氨酸含量的影响[J].热带亚热带植物学报.2008(3);3] 智慧,陈洪斌,凌莉。PEC处理对提高谷子种子活力方法的235-239.中国煤化工MYHCNMHGJournal of Jjlin Agriculural University 2009，October