蛋白的聚乙二醇修饰及其在生物医学领域的应用

78Foreign Medial Sciences Section on Phamacy 2001 Apr; 28(2)evaluation of proguanil: a probe phenotyping drug for thePhamacgenetis, 1998, 8(2):129- 135.mephenytoin hydroxylase polymorphism[J]. Br J Clin[20] lbeanu GC, Goldstein JA, Meyer U, et al. Identf-Pharmacol, 1996, 41(3):175- 179.cation of new human CYP2C19 lle(CYP2C19 * 6 and[16] Reidenberg P, Glue P, Banfeld CR, et al. Fflcts of fel-CYP2C19 * 2B) in a Caucasian poor metabolizer 0bamate on the pamacokineties of phenoberbial[J]. Clinmephenytoin[J]. J Phamacol Exp Ther, 1998, 286(3):Pharmacol Ther, 1995, 58(3):279 - 287.1490- 1495.[17] Xie HG, Huang SL, Xu ZH, et al. Evidence for the efet[21] Ibeanu GC, Blaisdell J, FergusonRJ, et al. A noved tran-of gender on activity of ( S )-mephenytoin 4-hydroxylasesversion in the intron 5 donor splice junction of CYP2C19(CYP2C19)in a Chinese population[J]. Phamacogenetics,and a sequence polymorphism in exon3 contribute to the poor1997, 7(2):115- 119.metabolizer phenotype for the anticonvulsant dug S-[18] de Morais SM，Wilkinson CR, Basell J, e al. Identmephenytoin[J]. J Phamacol Exp Ther, 199 290(2):cation of a new genetic defect responsible for the polymor-635- 640.phism of ()-mephenyoin metabolie in Japnee[J]. Mol [22] Xiao zs, Goldsteien JA, Xie HC, eal. Difrenes in thePharmacol, 1994, 46(4):594 - 598.incidence of the CYP2C19 polymophism afecting the S-[19] Ibeanu GC, Blaisdell J, Chanayem BI, et al. An aditinalmephenytoin phenotype in Chinese Han and Bai populatinsdefective llele, CYP2C19* 5, contributes to the S-meph-and infcation of a new rare CYP2C19 mutant alele[J].enytoin poor metabolizer phenotype in Caucasians[J].J Pharmacol Exp Ther, 1997, 281(1):604- 609.蛋白的聚乙二醇修饰及其在生物医学领域的应用付春晓综述(军事医学科学院野战输血研究所，北京100850)摘要:利用聚乙二醇及其衍生物对蛋白类生物大分子进行化学修饰,可以克服它们自身的缺点和不足，并赋予它们一些新的特点和功能,从而扩展其在生物医学领域的应用。本文综述了近年来在这方面的研究进展。.关键词:聚乙二醇;蛋白质;化学修饰中图分类号: Q518.4文献标识码: A文章编号: 1001-0971(2001)02-0078-04聚乙二醇(polyethylene gycol, PEC)修饰又称分PEG 修饰的目的主要有以下三个方面:(1)增加稳定子的PEC化(PEClation),是目前分子变构化学性,延长血浆 半衰期; (2)降低免疫原性和抗原性;(molecule altering structural chemistry, MASC) 最重要(3)降低毒副作用。的技术之一,是用来解决或缓解蛋白和多肽在药用1增加稳定性和延长血浆半衰期过程中存在的诸多问题的有效途径。PEG 是由乙二一些以注射方式使用的药用蛋白,由于在血液醇单体聚合而成的线性高分子材料,分子组成为中存留的时间过短,在很大程度上限制了其正常药HO-CH2-CH2-(-0CH2-CH2-0)n-CH-CH2-0H; PEC 链效的发挥。通过PEG修饰,一方面增加了分子量,还可以与马来酸酐进一步共聚形成梳状的PEG術降低了肾脏的排泄速率;另-方面,偶联的PEG链生物,简称PM。PEG分子中存在的大量乙氧基能够在蛋白分子表面产生空间位阻效应,减弱了血液中与水形成氢键,使PEG具有良好的水溶性;分子末端剩余的羟基通过适当方式活化后可与各类蛋白分各种” 中国煤化1，从而有效地延长了子相偶联。由于PEG无毒,具有良好生物相容性和蛋白TYHCNM H G°血液相容性,使它成为一种被广泛使用的生物修饰.1" rev诊印十皿灿田口血源短缺和血液污染的问题日益严重,使血液材料。对于各种具有药用潜能的蛋白来说,采用代用品的研究引起了人们的普遍关注。从牛红细胞收稿日期2095-12中获取的无基质血红蛋白(stroma-free bovine Hb )是国外医学药学分册2001 年4月第28 卷第2期79制备载氧型血液代用品的理想材料:它不仅具有来蛋白转化为非免疫原性的药用蛋白,主要是利用无源丰富和免疫原性低的优点,而且与人Hb不同,它免疫原性的PEG分子链与蛋白表面的可及性基团不需要2,3-二磷酸甘油酸(2,3~DPG,在血管中不存相偶联,进而在蛋白表面形成一道屏障,将暴露的抗在)的调节,仅凭循环系统中氯离子的调节作用就可原结合 位点屏蔽起来。分子构型独特的梳状PEC获得满意的氧亲和力,从而实现向组织有效供氧的具有更强的屏蔽功能,因而在这方面的应用更为普目的。然而,天然的无基质血红蛋白主要以二聚体遍。的形式存在,输入后很快就会被人体清除,造成很大2.1 PEG 修饰L.天冬酰胺酶的肾毒性。通过PEG与Hb分子进行偶联可以增大L-天冬酰胺酶(ASNase)具有抗白血病活性,能Hb的分子量,有效延长在血管内停留时间,显著降够催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸,将其与其他低肾脏排泄的速率[1-3)]。研究结果表明,采用不同化疗药物相结合是治疗白血病的一种有效手段。由的方法对其进行PEG修饰后, Hb在人体内的半于它在 血液存留时间短,长期接受治疗的白血病病衰期可由(3.0+0.1)h增加至(15.0+2.3),(17.4土人需要经常 注射。而ASNase是从大肠杆菌中提纯1.6)h,甚至(43.2+1.7)h。除此以外,利用PEG修出来的,在重复注射的条件下容易引发危险的免疫饰的方法还能降低牛Hb用于人体可能产生的免疫反应。为了保持ASNase在病人血液中的治疗水平反应,提高使用安全性。目前,通过大鼠兔、犬及猪并降低其免疫原性, PEG修饰是一种有效方法”。等动物的失血性休克实验和等容换血实验证实验证明,随着PEG构型及分子量的不同，在去除明,PEG-牛Hb是-种安全有效的载氧型血液代用其免疫原性的过程中对酶活性的影响也不相同;以品。1000 u的线型PEG为修饰剂,当ASNase的免疫活性1.2 PEG修饰超氧化物歧化酶被完全去除(由修饰前的100%降至0%)时,产物可超氧化物歧化酶(SOD)能够催化氧自由基的歧保留63%的天然酶活性;若采用PM100(100 ku的梳化反应,是机体清除有害氧自由基的重要的酶。.状PEG),无免疫活性的修饰产物可保留93%的天SOD对放射性损伤、氧中毒、再灌性损伤以及各种炎然酶活性。在修饰的程度相同时,采用高分子量的症,尤其是对类风湿关节炎均具有良好的治疗作用。PM100 将有更多的PEC链加入到被修饰的蛋白分然而,天然soD的血浆半衰期较短(在小鼠体内为6子中,因而其降低免疫活性的效果较低分子量的min,人体内25 min) ,限制了它的使用。为了弥补这PM13(13 ku的梳状PEG)要好。这在一定程度上说一缺陷,通常采用加大使用剂量的方法;然而不论是明ASNase免疫原性的降低是由PEG链屏蔽了酶表天然的还是从rDNA获取的SOD在大量使用情况下面的抗体结合位点引起的。都有引发过敏反应的危险。研究发现,利用PEG对2.2 PEG修饰牛血清白蛋白SOD进行化学修饰,以增加分子量,是延长其血浆存白蛋白是动物血浆中大量存在的一种功能蛋留时间的有效方法[4-6]。经高分子量的PEG(41 ~白,对于维持血浆胶体渗透压,调节血管内外的液体72 ku)修饰后,在较低的修饰度下产物的分子量增平衡具有重要意义,是临床上- -种用途广泛、需求量加到200~ 1000 ku。同天然SOD相比,这种高分子巨大的治疗试剂。然而昂贵的价格在很大程度上制量的PEG-SODs保持了90% ~ 100%的酶活性,血浆.约了它的应用。牛血清白蛋白(BSA)具有与人血清保留时间延长至35h左右并表现出更低的免疫原白蛋白相似的结构和功能，是--种很有开发潜能的性。PEG-SODs能够保持高的酶反应活性可能有以白蛋白代用品,而如何消除其免疫原性是一个关键下几个原因:(1)同SOD反应的底物均为小分子(各问题。 研究表明, BSA的PEG化是解决这个问题的种类型的氧自由基), PEG修饰虽可在酶的表面形成有效途径[8]。研究者分别以PM13和PM100对BSA-.定的空间位阻,但并不影响酶同底物的反应;进行修中国煤化工法测定了产物免疫(2)SOD表面的活性位点很小,受修饰反应的影响很活性剂时,当修饰度为小。30%,1.HC NMHG参与修饰反应时，不再能检测到产物的免疫反应活性;而以PM100为2降低抗原性和免疫原性修饰剂,当修饰度为20%就可达到同样效果,说明通过PEG修饰来消除免疫反应活性,将异原性在这方面后者的性能更为优越。80Foreign Meldical Sciences Section on Phamacy 2001 Apr; 28(2)3降低毒副作用时也在一-定程度上限制了药物向肿瘤组织的扩散, .通过基因重组技术获得的大规模生产的TNF-天然 TNF-a与PEC-TNF-a在药效上的差异是上述两a,II-2和IFN-Y等是一类很有前途的抗肿瘤新药。种因素共同作用的最终结果。总的来说, TNF-a经.但由于它们的血浆半衰期短,为达到显著的临床治PEG化处理之后，减少了使用剂量,降低了毒副作疗效果不得不加大使用剂量,这就常常引起严重的用,促进了它作为抗肿瘤药物的应用11,12]。毒副作用。近年来发现,利用PEG修饰技术对这些蛋白进行处理后，能够大大增加其血浆稳定性,降低4 PEG 修饰方法的局限性使用剂量;或在大的使用剂量下降低毒副作用(附在过去的30年中,蛋白的PEG修饰技术得到表)。近年来,PEG修饰已成为提高其抗肿瘤效能、了快速发展,自 1991 年PEG修饰的腺苷脱氢酶降低毒副作用的有效手段[9-4。(PED-ADA)首次获FDA认可以来,迄今已有40多个PEG修饰的蛋白药物被用于临床治疗各种疾病。但附表PEG 修饰蛋白及其应用该方法的应用也有其局限性,主要表现为:(1)扩散速度受限。经PEG修饰后,蛋白分子量显著增加，被修饰蛋白种类修饰目的用途无基质牛血红蛋白延长血浆半衰期,降 血液代用品药物自血液向目标组织的输送速度受到限制;(2)生低肾毒性物活性降低。PEG为链状高分子,在与蛋白表面特超氧化物歧化酶延长血浆半衰期,降清除氧自由基,定基团进行反应时,不可避免地会在- -定程度上破低免疫原性治疗关节炎坏或遮蔽了蛋白表面的活性位点,造成其生物活性L.天冬酰胺酶降低免疫原性治疗白血病的降低。解决这些问题,-方面可以通过对修饰反牛血清白蛋白血浆扩容剂应条件进行优化处理,确定最佳修饰度和产物的分白介素2增加水力动力学半径治疗肿瘤子量,以便在延长血液廓清时间和保证适宜的扩散肿瘤坏死因子~a增加抗肿瘤效能,降治疗肿瘤低毒副作用速度之间求得平衡;另-方面,设计合成新的具有高抗肿瘤抗体肿瘤定位治疗肿瘤选择性的PEG修饰剂也是非常必要的,以便控制修β葡糖苷酸酶抗体增加稳定性，改善药治疗实体肿瘤饰反应只发生在生物大分子的某些特定部位上,避代动力学特性免和减少对生物活性的影响。参考文献TNF-a是由激活巨嗜细胞产生的一种蛋白,具有重要的生理功能。TNF-a是一种颇有价值的肿瘤[1] Greenwald RB, Pendri A, Matinez A, et al. PEG thiaoli-治疗药物,它具有协同的抗肿瘤效能:-方面直接表dine2-thione, a novel reagent for facile protein modifica-现为对肿瘤细胞的细胞毒作用;另-方面可激活宿tian: conjugation of bovine hemoglobin [J]. Bioconjug主的抗肿瘤应答并选择性地引起肿瘤组织内部的微Chem, 1996, 7(6):638 - 641.循环障碍。但是, TNF-a在体内的清除速率很快,要[2] Conover CD, Malatesta P, Lejeune L, et al. The efects ofemdilution with polyethylene glycol bovine hemoglobin产生明显的抗肿瘤效果需要非常大的使用剂量,由(PEG-Hb) in a conscious porcine model[J]. J Inwest Med,此常引发一- 系列严重的毒副作用，包括发热组织炎1996, 44(5):238 - 246.症和组织损伤,甚至是致命的内毒素性休克样综合[3] Conover CD, Linberg R, Shum KL, et al. The ability of征。要将其转化为- -种有效的抗肿瘤药物必须有效palyethylene glycol conijugated bovine hemogobin (PEG-地降低毒副作用, PEG修饰正是为达到这一目的。Hb) to adequately deliver oxygen in both exchange transfu.-研究表明,利用mPEC5000与TNF-a分子中赖氨酸sion and toploaded rat models[J]. Arif Cells Blood Substit残基.上的伯氨基反应对TNF-a 进行化学修饰,通过Immobil Bictecnol, 1999, 27(2):93- 107.中国煤化工ia A, et al. Comparison of对修饰条件的优化处理,不仅能够有效减少毒副作YHC N MH G to deemine the extent of用,还可提高其抗肿瘤活性。当赖氨酸残基被修饰moification of methoxy polyethylene glycol 5000-modifed的程度分别为29%和56%时,其抗肿瘤活性分别增borine cupri- zinc superoxide dismuase[J]. Anal Biochem,加了4倍和100倍。与天然TNF-a相比,修饰产物1997, 254(2):254 - 262.的分子量明显增大，延长了药物的有效作用时间,同5] Sonack R, Saifer MC, Wlliams ID. Preparation of long-国外医学药学分册2001 年4月第28卷第2期81●acting superoxide discutase using high molecular weightnamt interleukin2 at its glycosylation site[J]. Biotehnologypalyethylene gyco[J]. Free Radic Res Commun, 1991,(NY), 1990, 8(4):343 - 346.12/13(Pt 2):553 - 562.[11] Tsutsuni Y, Kihira T, Tsunoda s, et al . Molecular design[6] Nuci ML, Olejarczyk L, Abuchowski A. Immungenicityof hybrid tumor necrosis factor alpha with polyethyene gycolof plyethylene gyol -modifed superoxide dismutase andincreaes its antis tumour potency[J]. Br J Cancer, 1995, .ctlse[J]. J Free Radic Biol Med, 1986, 2(5/6):321 -71(5) :963 - 968.325.[12] Tsutsumi Y, Kihira T, Yamamotc S, et al. 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Site directed pegylation of recombi-305 -315.心血管疾病的基因组学钟大光',李盟军2编译朱明伟' 审校(1.解放军总医院临床医学基础研究所,北京100853; 2.军事医学科学院科技部，北京100850)摘要:心血管疾病是遗传易感因子和环境因子相互作用的结果。在过去几年里,对一些遗传性非动脉硬化病如肥大性心肌病、扩张性心肌病、长_QT综合征和原发性高血压的分子基础的认识有了很大进展。本文概述了有关这些疾病的基因多态性研究的最新进展,讨论了这些发现如何更新了疾病的诊断观念,提出了一些防止和减轻这些疾病进展的预防性措施,最后讨论针对基因改变引起特定细胞或分子功能改变的新药开发情况。,关键词:基因;心血管疾病;药物中图分类号: RS4, Q78文献标识码: A文章编号: 1001-0971(2001 )02-0081-04心血管疾病是发达国家的主要死亡原因。近-疾病也不能排除遗传因素的作用。本文讨论以肥大个世纪以来,心血管病的发病率急剧增加,不仅导致性心肌病扩张性心肌病、长-QT综合征和原发性高患者早亡，而且昂贵的医疗服务费用也对社会造成血压为代表的非动脉硬化性心脏病。了巨大的经济负担。在过去几年里,这些疾病的分子基础研究取得心血管病分为两大类:动脉硬化综合征和非动了很大进展,已经发现了一些相关基因和危险因素。脉硬化综合征。动脉硬化、原发性高血压、心肌梗这些发现有助于早期诊断心血管疾病。有助于采取死、充血性心力衰竭和心律失常等疾病通常是两种预防性中国煤化工些疾病的进展。同因素共同作用的结果,其一是有形成心脏病的遗传时对新!YHCNMHG易感性,其二是环境因子。心脏炎症性疾病如风湿1心血管病基因组学的研究方 法热、病毒性心肌炎可能构成第三类病。然而这一-类对于复杂的多基因或多因子疾病,最常采用的确定易患基因或致病基因的方法是确定候选基因,收稿日期3朔数搪