锦橙叶片POD动力学研究

果树学报2001,82)72-74Journal of Fruit Science锦橙叶片POD动力学研究谢永红甘霖吴正琴(重庆市果树研究所江津40260)摘要以锦橙成熟春梢叶片提取过氧化物酿POD)分别测定了该酶的最适μ最适温度及酶促动力学参数Km值和vmax值比较分析了常见几种POD抑制剂的作用程度。结果表明以邻甲氧基酚为底物叶片POD的最适p为5.0,最适温度为32℃Km值为28.04mmwl/L,vmsx值为147.83umit/sgFw。在所测的6种抑制剂(K+、P2+CN、Vc硫脲及L半胱氨酸)CN硫脲和L半胱氨酸对POD表现岀较强的抑制作用K对PD活性起促进作用。在一定浓度范围內各种抑制剂的作用程度与其浓度具有极显著的相关性。关键词锦橙春梢叶片OD动力学中图分类号:S66.4文献标识码∶文章编号:009-9980(2001)02-072-03Study on Dynamics of Peroxidase in the Leaf of Orange cv. JinchengXie Yonghong Gan Lin and Wu ZhengqingChongging Fruit Research Institite, Jiangjin 402260)stract Peroxidase( POD )in the spring leaf of orange cv. Jinchen CitrusOsbeck )was extracted. The optimum pHoptimum temperature, Km Vmax and common inhibitors for POd were analyzed. The results showed that the optimum pH andtemperature were 5.0 and 32 C respectively Km and Vmax of POD with guaiacol substrate were 28. 04 mmol/L and 147.83B2+ thiourea and L-cysteine were strong inhibitors, but K+ was an activator for POD in sixinhibitors measured. In a proper range of inhibitors concentration the degrees of inhibition of all the inhibitors have a significantorrelation with its concentrationKey Words Orange cv. Jincheng Spring leaf POD Dynamic过氧化物酾( peroxidase,r∽OD活性在植物生理园内10年生枳砧锦橙( Citrus sinensis osbeck城熟的研究中是一个非常重要的生理指标。一些学者曾报春梢叶片为试材每年6月取样重复测定3次。道了POD活性与种子活力1、组织衰老2品种耐1.2POD的提取缺铁性3及分枝数和产量4的相关性。在柑橘和苹将叶片用蒸馏水洗净定量滤纸吸干除去叶片果上也采用PO活性及其同工酶来鉴定砧木的矮主脉后萬成碎片。称取1g样品加少量蒸馏水和石化程度5-η。吕斌等研究了多种柑橘砧木及嫁接树英砂研磨成浆定容到100m稀释5倍后1000×叶片POD活性与树体生长与结果的关系8以上g离心l0min上清液即为酶测定液。都是从POD活性及其同工酶多型性加以研究。有1.3POD的测定关树体中POD特性及其动力学研究较少如何对该愈创木酚法01:在指形试管中加入1mL酶液、酶进行有效的调控未见报道。本文从锦橙叶片中提1mL1%愈创木酚和1m0.1mo/LpH5.0的HAe取POD并对酶的某些特性、动力学参数及常用抑制NaAc缓冲液摇匀后置于30水浴预热5min然剂的作用效果加以研究,为该酶的合理调控提供依后快速加入1mL0.08%H2O2并开始计时立即用据紫外可见分光光度计测定1min内△ODm。一个酶材料和方法活性单位为每g鲜样在1s内使OD值升高0.1(以umi/sgW表示1.1材料1.4中国煤化工的测定1999~2000连续两年以重庆市果树研究所甜橙CNMHG度(范围10-100℃0收稿日期200007-19接受日期000-1220基金项目重庆市自然科学基金资助项目编号995759)谢永红男副研究员。果树学报18卷间隔2℃啦H5.0湘和不同p范围3.2~6.4,间隔大于5.0时POD活性随pH的升高而降低当pH为0.2温度30℃)条件下测定POD活性,以最大活性6.4时POD活性为最大活性的33.7%。管为100%计算相对活性。1.5 POD Km值和vmax值的测定以邻甲氧基酚为底物没置1、241020mmol/的底物浓度分别测定POD活性。用双倒数曲线回归法Ⅱ计算Km值和Vmx值1.6抑制剂对POD活性影响的测定在酶促反应中加入不同的抑制剂每种抑制剂设置5个浓度2、46、8、10×10-5moL),分别测定POD的活性Ⅴ并计算各抑制剂不同浓度的扣制程度以不加抑制剂的POD活性V为对照抑制程3035404.5505.560度%)=(1-V/Vo)×1002结果与分析图2pH对POD活性的影响Fig 2 Efect of pH on POD activity2.1温度对POD活性的影响由图1可以看出锦橙叶片PD的最适温度为23POD酶促反应的动力学参数Km和Vmax32℃在30~34℃范围内POD相对活性大于97%利用双倒数法对1s和1/作图图3)并进低温(14℃以下)可抑制Po活性达50%左右14行线性回归汁计算出锦橙叶片POD以邻甲氧基酚为32℃范围内PO活性随温度的升高明显增加温底物的Km值为28.04mmod/ L, Vmax值为147.83U度系数Qn为0.51超过酶的最适温度POD活性随8gW。说明PO与邻甲氧基酚的亲和力较好温度的增加而降低当温度升高到58℃时酶相对活性降为59.4%当高达84℃时酶完全变性失去活性y=0.1897x+6.763R2=0.971vmax=14783Uis·gFWKm= 28.04 mmol L底物浓度倒数Reciprocal of shstratc conccntration ls](I-mol.图3POD酶促反应双倒数曲线203040506070809010010Fig 3 Double reciprocal plot of POD enzymatic reaction温度 Temperature( t)2.4不同扣制剂对POD活性的影响图1温度对POD活性的影响不同抑制剂对POD的抑制作用有明显差别表Fig 1 Ettect of temperature on POD activity1)L-半胱氨酸、硫脲、P2+、CN-对POD活性有明显抑钆作用茸中⌒的制效果最好,在10×22pH对POD活性的影响中国煤化工10Ⅴc对POD活性影响图2表明该POD的最适p为5.0与愈创木较小CNMH刂率仅为14.89%。而酚法0测定POD活性要求的pH值一致。当pH小K+的存在可提高PoD活性,当浓度为8×10-5于5.0时PO活性随pH值的降低而下降,特别是mol/L时POD活性提高26.6%在一定浓度范围内在pH为4.4-5.0范围内这种变化更为突出。当pH每种抑制剂的抑制效果与其浓度具有极显著的相关为3.2时POD活性仅为最大活性的242%。当pH性抑制率Y%卢与浓度X×10-5mol/L)的回归方2期谢永红等綿橙叶片POD动力学研究67程分别为0.691R2=0.9990)K+:Y=0.169X3-2.5955X2+7.032XCN-:Y=-0.302X3+5.2835X2-17.613X+4.468KR2=0.9892)35.319(R2=0.9740*)Vc:Y=0.0277X3-0.5462X2+3.983X+L半胱氨酸:Y=0.0609X3-1.1018X21.9681(R2=0.99981217X-9.3085(R2=0.9998)Pb2+:Y=0.1718X3-2.0564X2+8.099X硫脲:Y=3.8369X0%(R2=0.9876*)表1不同抑制剂对锦橙叶片POD活性的影响Table 1 Effects of different inhibitors on POD activity抑制剂各浓度(×10-5m/L的抑制程度回归方程Degree of inhibition( %KCI Potassium chloride0.275.85-21.01-26.60-25.00Y=0.169X3-2.5955X2+7.032X-4.46810.9892*PhSOA Anglesite9.3111.7019.9546.54Y=0.1718X3-2.0564X2+8.099X-0.69150.9990氰化钾 Potassium cyanide19.9525.5361.4473.4086.70Y=-0.302X3+5.2835X2-17.613X+353190,9740Ascorbic acid7.9810.9012.2313.0314.89Y=0.0277X3-0.5462X2+3.983X+1,96810.9998硫脲 Thiourea69111.1714.6319.9525.27Y=3.8369X0790.9876L-半胱氨酸L- Cysteine5.0513.3019.15242032.71Y=0.009X-1.1018X+9217X-930850.998注1.Y代表抑制程度%)代表抑制剂浓度(×10-5mo/L)2.表中数据用相关系数法检验,*表示达极显著相关水平(n=5)Note 1. Y degree of inhibition ,X content of inhibitors, 2. The data in table were analysized with correlative coefficient method, * significant at P<1%影啊J]园艺学报1998252)l3讨论[2]张丽欣宗汝静.四种叶菜衰老期间呼吸、乙烯产生JA和过试验表明锦橙叶片POD的最适温度为32℃氧化物酶的变化及其相互关系J,植物生理学报,998,41)8l-89最适pH为5.0偏离最适温度和最适pH酶活性将[3李式军汪李平,水培生菜缺铁胁迫品种的筛选及其生理特性明显降低不同抑制剂及其浓度对POD活性影响具研究J园艺学报1952X2):147-152有明显差异。因此树体在不同环境条件下其POD【4]杨暹关佩聪陈玉娣.青花菜东京绿侧枝数与产量及过氧化物活性各不相同这将直接影响树体的生理状态和生酶活性研究J园艺学报19952x2)157~160长发育情况。利用外界因素或人为因素如温度、土[5]李文斌张映南刘庚峰簿柑桔矮化砧及半矮化砧过氧化物酶同工酶及活性的比较J园艺学报198964)261-265壤pH土壤重金属含量及钾离子浓度等对POD活【61李秀玲马仁懿苹果矮化钻与乔化钻过氧化物酶同工酶的比性进行有效的调控使其达到较适宜的酶活性范围,较研究J]植物学报J9812x1)82~84以满足柑橘不同时期树体、果实生长发育的需要这〔η]胡国谦涨谷雄周中建筹.利用叶片过氧化物酶同工酶鉴定在果树栽培和生理研究中都具有重要的意义。柑桔砧木资源矮化性能J]热带作物科技,1992,1(1):15本文仅以邻甲氧基酚为底物对锦橙叶片POD[8]吕斌陈学年李质怡等.不同砧木先锋橙叶片POD活性与树的某些特性及常见抑制剂进行了试验有关其它底体生长势的关系J]西南农业学报99x(2)63-67物的情况、POD的其它特性以及不同扣制剂的相互[9门欧毅毛启才曹照春等不同砧木锦橙叶片过氧化物酶活性作用等有待进一步研究。在酶对外界调控因子的表与植株生长结果的关系J]云南农业大学学报,199491)23达研究中尚需进行POD同工酶分离与活性分析以确定各调控因子的主要表达蛋白和表达强度。[10]陈秀伟冯叙桥.农产品贮藏运销学实验教稙M]重庆西南中国煤化工参考文献CNMH Gmination of enzyme dissociationcontantAmer Chem Soc, 1934 56 585-688[1]吴岳轩曾富华空间飞行对番茄种子活力及其活性氧代谢的