一种双水相亲和分配配基的制备过程优化--亚氨基二乙酸-聚乙二醇

第19卷第2期化学反应工程与工艺Vol 19, No 22003年6月Chemical Reaction Engineering and TechnologyJun，2003文章编号: 1001 - 7631(2003)02 - 0129 - 06一种双水相亲和分配配基的制备过程优化亚氨基二乙酸一聚乙二醇文禹撷，林东强，陆瑾，姚善泾(浙江大学化学工程与生物工程系，浙江杭州310027)摘要:考察了不同亚氨基二乙酸(IDA)取代度的亚氨基二乙酸一聚乙=醇(IDA- PEG)的制备,并进行了条件优化(BFs浓度,NaOH浓度.反应时间,IDA结合条件等)。通过控制环氧氯丙烷与聚乙二醇的摩尔配比，得到了不同Cu( I )含量的固定化金属亲和配基:Cu(I )- IDA- PEG(A)(0. 24 molCu2+ /molPEG).Cu( 1 )-IDA- PEG (B)(0. 51 molCu2+ /molPEG) .Cu( I )- IDA- PEG(C) (0. 75molCu2+ /molPEG),并初步探讨了固定化金属亲和配基的添加对PEG4000-(NH4)2SO,-H2O双水相系统相图的影响。关键词:固定化金属亲和分配，亚氨基二乙酸- 聚乙二醇;双水相系统中图分类号: Q819.文献标识码: A1前言固定化金属离子亲和层析(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)是-种高效分离蛋白质的方法1.2] ,利用过渡金属离子对蛋白质表面的富电子氨基酸残基(如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等)的特异性相互作用可以达到亲和分离的目的[3]。把金属离子亲和作用引入双水相系统,利用结合在成相聚合物上的金属亲和配基,可大大提高双水相分配的选择性。Birkenmeier 等[4利用PEG衍生物结合不同金属离子,分离a2-巨球蛋白、过氧化物歧化酶和单克隆抗体等,结果表面固定化金属离子亲和分配对于分离蛋白质很有潜力。Sivars 等5I利用含有金属螯合聚合物(如Cu( I )-IDA-PEG和Cu(I)-IDA-葡聚糖)的表面活性剂/聚合物双水相体系分离纯化了辅酶Q、细胞色素,结果表明金属亲和分配可以有选择性地分配含有聚组氨酸末端的膜蛋白,其分配系数从0.015增加到4.8。Maria等间利用金属亲和分配纯化了粗大豆过氧化物酶,分配系数为24,酶收率达到64%。亚氨基二乙酸(IDA)是较强的金属离子螯合剂,亚氨基二乙酸-聚乙=醇(IDA- PEG)则是双水相分配中常见的固定金属离子亲和配基。通常,PEG上结合IDA需经历三步合成反应5:(1)在氮气环境中利用单甲氧基- PEG(M - PEG)与二氯亚砜反应得到CI-M- PEG;(2)中间产物Cl一M- PEG与氨水反应生成NH,- M一PEG;(3)NH2-M- PEG在碱性环境中与溴乙酸反应生成IDA-PEG;该合成方法步骤繁杂,得率较低。借鉴Porat中国煤化工epharose.上结合IDA的方法,Pesliakas等[8报道了在水溶性聚合物上螯合YHCN MH GG与等量的环氧氯丙烷反应生环氧活化PEG,然后与IDA反应生成IDA- PEG。Lin等9对此合成条件进行了优化,得到了收稿日期:2002- -07 - 12;修订日期:2002 -01-18.作者简介:文禹撷(1978-),男,硕士研究生;姚善泾(1957-),男,教授,博士生导师,通讯联系人。基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:20076042)130化学反应工程与工艺2003年Cu( I )含量为0.5 molCu2+ /molPEG的Cu( I )-IDA- PEG。本工作沿用Lin等[9]的合成路线,对IDA- PEG制备方法进行系统优化,主要对催化剂BF3浓度、NaOH用量、反应时间、反应物初始配比、IDA结合条件等各种因素进行考察,以期得到不同Cu2+含量金属离子亲和配基,并对PEG4000- (NH)2SO,-H2O双水相系统中添加Cu( I )-IDA- PEG时的相图变化进行探讨。2材料与方法2.1材料聚乙二醇(PEG ,浙江巨化集团生产),平均分子量为4000(3500- 4500) ;亚氨基二乙酸(IDA,中国医药集团上海化学试剂公司);环氧氯丙烷(中国化学试剂站中心化工厂);硫酸铵、氢氧化钠、甲醛、乙醚等其它试剂均为市购分析纯。2.2实验部分2.2.1 Cu( I )- IDA-PEG的合成(1)PEG环氧活化采用 类似缩水甘油醚合成方法[10]。反应包括2步:(a)无水酸性环境中,三氟化硼-乙醚催化环氧氯丙烷的环氧键开环,与PEG上羟基反应制得氯代PEG;(b)氯代PEG在氢氧化钠作用下脱氯化氢生成环氧活化PEG。通过无水乙醚沉淀获得环氧- PEG,得率一般为85%。(2)IDA的结合取 2mol/L的Na2CO3溶液,加入20倍于环氧- PEG摩尔数的亚氨基二乙酸溶解后,往其内加入环氧-PEG。在65C下搅拌反应24h,冷却后,加入氯仿萃取2次,合并氯仿相加入无水Na2SO,脱水后,利用旋转蒸发器蒸干氯仿,在4C下无水乙醚沉淀获得IDA- PEG。该合成过程得率为80%。(3)金属离子的螯合取 20g CuSO。●5H2O溶于125mL 50mmol/L的乙酸钠溶液(pH4.0),加.入25g IDA-PEG。室温下搅拌1h后，用氯仿萃取2次,合并氯仿相,蒸干氯仿,4C下无水乙醚沉淀，烘干获得21g Cu( I )-IDA- PEG。2.2.2 双水相相图测定称取不同量的Cu( I )-IDA- PEG配基、PEG4000母液(40%w)、(NH)2SO,母液(40%w)和水于刻度离心管中,加盖,上下倒置50次,充分混合后,离心(5000r/min)5min,20C水浴静置24h,待相界面稳定后,读出上下相体积数,分别移取上下相溶液分析(NH4)2SO,和PEG的浓度。2.2.3检测方法环氧基含量测定采用卤化季 铵盐- -高氯酸法111.IDA含量测定采用 凯氏定氮法[12]Cu含量测定采用原子吸收光谱法硫酸铵测定采用 甲醛滴定法。利用甲醛与铵盐作用生成等摩尔的硫酸,用NaOH滴定。该法测定硫酸铵，相对误差为0.35%。实验结果表明，聚乙=醇的存在对甲醛法测定硫酸铵无影响。PEG含量测定称取一 定量双水相系统上下相样品干65C直空干慢至恒重,从总干重减去中国煤化工(NH,)2SO,量,即得PEG量。该法测定混合液中PI25%。YHCNMHG3结果与讨论3.1 环氧活化PEG的制备3.1.1BF。浓度及反应时间的影响BF3催化环氧氯丙烷的环氧键断裂,与PEG的羟基端结合,因而对环氧基取代度有着显著的影第2期文禹撷等，，-种双水相亲和分配配基的制备过程优化亚氨基二乙酸-聚乙二醇.131响。考察了室温下、不同环氧氯丙烷与PEG配比时,BF:浓度对环氧基取代度的影响。由图1可见,随BF3浓度的增加，环氧基取代度先增加后减小,对不同环氧氯丙烷与PEG的配比,BF3浓度在0.5%时,环氧基取代度最高。进-步考察了不同环氧氯丙烷与PEG配比(1.5: 1,2: 1, 2.5: 1),反应时间的影响,结果表明:①对于不同反应物配比,环氧取代度随时间的变化规律基本类似,图2给出.了配比为1.5:1时的反应时间曲线;②随着BF。浓度增加,初始反应速度有所增大;③随着反应的进行,环氧基取代度逐渐增加,在20h左右出现最大值，其后环氧基的取代度反而会降低,可能是由于交联副反应引起的。因此,在最佳的反应条件(BF:浓度0.5%,反应20h)下,环氧基取代度达到最高。0.81.00.6盈0.80.4).20 0.25 0.5 0.75 1 1.250l02030 40concentrtion of BF3.%reaction time/h图1BF:浓度对环氧取代度的影响图2反应时间对环氧取代度的影响Fig 1 Effect of BFg Concentration on Epoxide YieldFig 2 Effect of Reaction Time on Epoxide Yield加2. 5mLNaOH(40% )/100mL后反应5h,环氧氯丙烷加2. 5mLNaOH/(40%)100mL后反应5h,环氧氯丙烷与PEG的摩尔配比:◆1.5: 1.■2: 1,▲2.5: 1与PEG的摩尔配比:1.5: 1,BF3 的浓度:◆0. 25%，I ■0.5%,▲0.75%3.1.2氢氧化 钠浓度及反应时间的影响:氢氧化钠使得氯代PEG脱氯化氢形成环氧键,因而直接影响了环氧基取代度。图3给出了环氧氯丙烷与PEG的初始摩尔配比分别为1.5: 1,2: 1,2.5: 1时,加入0.5%BF3反应20h后,氢氧化钠用量的影响。结果表明:氢氧化钠的用量太低不利于环氧键的生成;当40%(w)氢氧化钠的用量达到2.5mL/100mL反应液时,环氧基取代度基本达到最大,继续增加氢氧化钠的用量,对环氧取代度影响不大。1.2 |1 0.8冒0.st冒.2 I34567volume of 40%(w/w) NaOH . mL/ 100mLtime after ndding Na0H/h中国煤化工图3NaOH用量对环氧取代度的影响对环氧取代度的影响Fig 3 Effect of NaOH on Epoxide YieldCNMHGTimeonEpoxideYield加40%NaOH/100mL后反应5h,环氧氯丙烷环氧氯丙烷与PEG的摩尔配比:1.5: 1,40%NaOH溶液与PEG的摩尔配比:◆1.5: 1,■2: 1,▲2.5: 1加入量:◆1.5,■2,▲2.5mL/ 100mL加入氢氧化钠后的反应时间同样影响着环氧取代度的高低。对不同的环氧氯丙烷与PEG初始摩尔配比,加入0.5%BF:反应20h后,环氧基取代度随着与氢氧化钠反应时间的延长而增大,在5h左.右达到最大;但是反应继续进行,取代度稍有下降。图4给出了环氧氯丙烷与PEG的初始摩尔配比为132化学反应工程与工艺2003年1.5: 1,40% (w)氢氧化钠的用量分别是1.5mL/ 100mL ,2mL/ 100mL,2.5mL/100mL的情况。该反应步骤要求温度控制在20C以下。3.1.3环氧氯丙烷与PEG配比的影响结果如图5所示，在最佳的反应条件下,环氧取代度基本上同环氧氯丙烷与PEG的摩尔配比呈线形相关，因而可通过控制环氧氯丙烷与PEG的摩尔配比制得不同环氧取代度的环氧活化PEG。3.2 IDA- PEG的合成环氧活化PEG进-步与金属螯合剂IDA反应,可以制得IDA-PEG。IDA的用量、反应温度和反应时间是该反应过程的关键因素。图6表示IDA用量对IDA结合密度的影响。由图可以看出IDA的结合密度随IDA用量的增加而增大。当IDA/PEG的摩尔比达到20时,IDA的结合密度基本达到最大，此后随IDA用量的增加影响不大。图7表示反应温度对IDA结合密度的影响。随着温度的增加,IDA结合密度也增大,65C左右达到最大值,此后温度升高,IDA结合密度略有下降，故适宜的反应温度为65C。图8表示反应时间对IDA结合密度的影响。从图中看出,随着反应的进行,IDA结合密度增大,当反应进行到20h后,IDA的结合密度变化很小。由此可得,IDA与环氧活化PEG的最佳反应条件是2mol/L的Na2CO3溶液中,亚氨基二乙酸与环氧一PEG的摩尔配比为20,反应温度65C,反应时间24h。11.0.80.6g飞040.2百020.000.5.52.51020304(mol mtio of epichirolydring : PBGmol ration oIDA : PEG图5反应物比例对环氧得率的影响图6 IDA 浓度对IDA- -PEG制备的影响Fig 5 Effect of the Reactant Ratio .Fig 6 Effect of IDA Concentration onBF:浓度: 10. 50%IDA- PEG0.8 t香管o6冒040.4 t冒“I060128eaction temprature 1C中国煤化工/图7反应温度对IDA-PEG制备的影响MHCN M H GA-PEG制备的影响Fig 7 Efect of Reaction Temprature on IDA- PEGFig 8 Effect of Reaction Time on IDA-PEG环氧氯丙烷与PEG的摩尔配比:◆1.5: 1环氧氯丙烷与PEG的摩尔配比:◆1.0: 1,■1.5: 13.3 Cu(I )的螯合结果如图9所示,Cu2+含量基本上与IDA结合密度一致,Cu2+的螯合率能够达到90%以上,说第2期文禹撷等，，-种双水相亲和分配配基的制备过程优化亚氨基二乙酸-聚乙二醇.133明Cu2+和IDA--PEG螯合是比较容易进行的。在最优条件下,通过控制环氧氯丙烷与聚乙二醇的摩尔配比,可得到了不同Cu( I )含量的固定化金属亲和配基:Cu( I )-IDA-PEG (A) (0. 24 mol-Cu2+ /molPEG)、Cu( I )- IDA- PEG (B) (0. 51 molCu2+ /molPEG)、Cu( I )一IDA- PEG (C)(0.75molCu2+ /molPEG)。3.4 PEG-(NH,)2SO,- H2O双水相系统相图的影响测定了双水相系统中10%的PEG被不同Cu2+含量的Cu(I)-IDA-PEG替代后对系统相图的影响。结果如图10所示,对于不同Cu( I )- IDA- PEG配基,相图的差别非常小。说明在用Cu .(I)-IDA-PEG作为金属螯合亲和配基添加到双水相系统中时,可以忽略Cu(I)-IDA-PEG.的影响,直接用原系统的相图。.0030}0.82S }0.6200.45t0020.00.5:11.0:1152(mo ratio of eiclorohydring : PEGsal(6/u),%图9Cu(I)在IDA-PEG上的螯合量图10 PEG4000/ (NHJ)2SO,/H2O相图(20C)Fig 9 Content of Cu( I ) Combined .Fig 10 Phase Diagram forwith IDA- PEGPEG4000/(NH4)2SO,/H2O (20C)■IDA,OCu( 1 )聚合物组成:◆PEG,■Cu(I )-IDA- PEG(A).▲Cu( I )- IDA- PEG(C)4结论通过调节环氧氯丙烷与PEG的摩尔配比可以制备得到不同IDA取代度的IDA-PEG。环氧活化PEG的反应条件为:室温下BF3浓度0. 5%,反应时间为20h ;40%(w)NaOH用量为2.5 mL/100mL,反应时间5h。IDA与环氧活化PEG的优化反应条件: 2mol/LNa,CO3溶液中,IDA与环氧- PEG的摩尔配比为20,反应温度65C ,反应时间24h。.在最优条件下,通过控制环氧氯丙烷与聚乙二醇的摩尔配比,可得到了不同Cu(I)含量的固定化金属亲和配基:Cu( I )-IDA- PEG (A) (0. 24 molCu2+ /molPEG)、Cu( I )-IDA- PEG (B)(O.51 molCu2+ /molPEG).Cu( I )-IDA-PEG (C) (0. 75molCu2+ /molPEG)。双水相系统相图的初步考察结果表明,10%PEG被不同Cu2+含量的Cu(I)-IDA-PEG替代后对双水相系统相图的影响不大。中国煤化工MYHCNMH G参考文献:[1] Sulkowski E. Purification of Proteins by Immobilized Metal Affinity Chromatography[J]. Trends Biotechnol, 1985， (3);1.[2] Wong J w, Albright R L, Wang N H. Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC): Chemistry and Bioseparation Ap-plication[J]. Purif Methods, 1991, 20(1):49.[3] Carlsson J, Mosbach K. Buelow L. Affinity Precipitation and Site Specific Immobilization of Proteins Carrying Polyhistidine134化学反应工程与工艺2003年Tails[J]. Biotechnol Bioeng, 1996,51<2):221.[4] Birkenmeier G, Vijayalakshmi A M, Stigbrand T, et al. Immolilized Metal lon Affinity Partitioning ,a Method Combining Met-al-Protein Interacion and Partitioning of Proteins in Aqueous Two Phase Systems[J]，J Chromatogr. 1991， 539(2) :267.[5] UIf Sivars, Jeff Abramson, So Iwata, et al. Tjerneld. Affinity Partitioning of a Poly (histidine )- tagged Integral Membrane Pro -tein ,Cytochrome bo3 Ubiquinol Oxidase ,in a Detergent- Polymer Aqueous Two Phase System Containing Metal Chelating Poly-mer[J]J Chromatogr B, 2000.743.[6] Maria Estela da Silva, Telma Teixeira Franco. Purification of Soybean Peroxedase (Glycine max) by Metal Affinity Partitioningin Aqucous Two Phase Systems[J]. J Chromatogr B, 2000, 743:287.[7] Porath J, Olin B. Immobilized Metal lon Affinity Adsorption and Immobilized Metal lon Affinity Chromatography of Biomateri-als ,Serum Protein Affinities for Gel Immobilized lron and Nikel lons[J]. Biochemistry, 1983. 22(7):1621.[8] Pesliakas H, Zutautsa V, Baskeviciute B. Immobilized Metal lon Affinity Partitioning of NAD+ -Dependent Dehydrogenases inPoly(ethylene glycol ) _Dextran Two- Phase Systems[J]. J Chromatogr，1994， 678(1):25.[9] LinD-Q, YaoS-J, MeiL-H, et al. Preparation of Iminodiacetic Acid- Polyethylene Glycol for Immobilized Metal lon AffinityPartitioningDJ]. Chinese J of Chem Eng. 2000， 8(4):310. .[10] Ulbrich V, Makes J, Marrecek M. Identifizierungder Glycidylather Bis Pheny- and Bis- a alky (aryl )ather Desglycerins[J].Collct Cech Chm Commun, 1964, 29(6):1466. .[11] 张志贤，张瑞镐.有机官能团定量分析[M]. 北京:化学工业出版社，1990.[12] 杨桂法，王玉枝，杨霞,等.有机化学分析[M].湖南:湖南大学出版社, 1996.Synthesis Process of an Affinity Ligand for Aqueous T wo- phasePartitioning一Iminodiacetic Acid-Polyethylene GlycolWEN Yu-xie，LIN Dong -qiang，LU Jin，YAO Shan jing(Department of Chemical and Biochemical Engineering，Zhejiang University,Hangzhou 310027，China)Abstract:The synthesis process of iminodiacetic acid - polyethylene glycol (IDA PEG) with vary-ing content of IDA was investigated. The process was optimized under BF: concentration，NaOHconcentration，reaction time, and IDA coupling conditions. It was found that the amount of copper( I ) on the immobilized metal ion affinity ligand is related to the molecular ratio of epichlorohydrin :to PEG in the synthesis process. Under optimal conditions, three affinity ligands of Cu( I )- IDA- PEG were prepared with different Cu ( I ) concentrations， 0. 24 mol/molPEG，0. 51 mol/molPEG，0. 75 mol/molPEG, respectively. The effect of the immobilized metal ion affinity ligandon the phase diagram of PEG4000- (NH)2SO4-H2O aqueous two- phase systems was discussed.Key words : immobilized metal ion affinity partitioning; iminodiacetic acid- polyethylene gly-col; aqueous two phase systems中国煤化工YHCNMH G