树干毕赤酵母发酵木糖生产燃料乙醇

第36卷第1期酿酒voL.36.N.12009年1月LIQUOR MAKING文章编号:1002-8110(200901-0023-04树干毕赤酵母发酵木糖生产燃料乙醇张亚云,丁长河,李里特,王艳敏,王罗琳(河南工业大学粮油食品学院郑州,450052)摘要:人们从自然界中筛选得到的能利用木糖发酵生产乙醇的酵母菌中,树干毕赤酵母具有很大的优势。它不仅可以发酵木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖,而且可以发酵纤维二糖和木二糖;同时培养基中没有生物素和硫胺素也可正常发酵,并且它发酵木糖的乙醇转化率较高几乎接近理论值0.51g/g。主要讲述了环境因素如培养基成分、pH、温度、乙醇浓度和底物浓度、通氧量大小等对树千毕赤酵母发酵木糖生产乙醇的影响。关键词:树干毕赤酵母;木糖;燃料乙醇;发酵中图分类号:TS2622;TS2614;TS26111文献标识码:BFermentation of D-xylose for Ethanol Production by Pichia StipitisZHANG Ya-yun DING Chang-he, LI Li-te, WANG Yan-min, WANG Luo-lin(Grain and Food College, Henan University of Technology, Zhengzhou 450052, ChinAbstrct: Among the xylose-fermenting yeasts for ethanol production, Pichia stipitis was considered as the best microorganism forindustrial application. it can utilize a wide range of sugars, including xylose, glucose, mannose, galactose, and even some disac-charides, such as cellobiose and xylobiose. Furthermore, there was no absolute requirement for biotin and thiamine in the fer-mentation with a high ethanol yield( near to the theoretical yield 0.51g/g). The objective of the present work are to study the ef-fect of medium composition, pH, temperture, the concentration of ethanol and substrate, and aeration rate on the xylose fermenta-on by Pichia stipitis.Key words Pichia stipitis i Xylose Ethanol Fermentation收稿日期:2008-09-18随着天然气、石油等能源的急剧消耗,汽车燃料需求的不·基金项目:河南省杰出人才创新基金贡助项目。项目编号:062100断增加环境污染等问题的日益恶化,寻找开发新能源减少作者简介:;张亚云(1982-),女,山西长治人,在读硕士研究生,研究方向为粮食、油脂与植物蛋白综合利用。环境污染的有效途径,显得越来越重要。近年来,乙醇作为一或采用调控手段来提高糖化酶的催化水解淀粉能力将带来突6] Nathalie Juge, Marie- Fran coise Le Gal-Co" fetI. Caroline SM.破性的进展Furnissl, etc. The starch binding domain of glucoamylase from[参考文献]Aspergillus niger: overview of its structure, function, and role in[Coutinho, P. M and Reilly. PJ Glucoamylase structural, functional, andraw-starch hydrolysis[.Biologia Bratislava, 2002, 57(11): 239evolutionary relationships[J]. Proteins, 1997, 29: 334 347.[sOrimachi K,Le Gal-Coeffet MF, William[2 SauerJ-SigurskjoldRW-ChristensenU-Frandsen,TP, Mirgorodskaya Estructure of the granular starch binding domain of glucoamylasefrom Aspergillus niger glucoamylase bound to B-cyclodextrin[Irelationships, and protein engineering [J].Biochim. Biophys.Acta2000,1543:75-293.[8] vensson B. Larsen KSvendsen Let al.The complete amino acid[CHiba, S Molecular mechanism in a-glucoesequence of the glycoprotein, glucoamylase Gl, from Aspergillus[) Biosci Biotechnol. Biochem, 1997, 61: 233 1239.niger J) Carlsberg Res Commun, 1983, 48: 529-5444JWei-IChodTun-Wen Pafhi-HweiLiuetdhefamily 21carbohydrate-hind- [9 Gary WILLAMSON, Nigel J BELSHAW and M P WILLAMSONLing module of glucoamylase from Rhizopus oryzaeO-Glyoosylation in Aspergillus glucoamylase: Conformation and rolesites playing distinct mles in ligand binding []Biochem J.2006,396(binding J). 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Structure of glucoamylaseNucleic Acids Res, 2005.33: 247 251from Saccharomycopsis fibuligera at 1.7 A resolution [].ActaCrystallogr D Biol Crystallogr. 1998-54(5): 854-866第一期2009种能效高、清洁、安全、可再生代替资源受到了全世界人们的重视我国每年有大量的农业废弃物,如玉米杆、稻草、麦秸、甘蔗渣等纤维质原料。秸杆的主要成分是木质纤维材料( lignocellulosic materials),主要由纤维素、半纤维素和木质素组成半纤维素占木质纤维材料成分的20%-35%,天然半纤维素水解产物的85%~90%是木糖但是目前它们大多数没有被合理的利用,开展利用农林废弃物生产燃料乙醇的研究不仅可以解决农林废弃物的利用问题,而且可以缓解粮食和能源紧张。因此利用植物纤维材料发酵生产乙醇的研究,具有十分重要的现实和长远意义。生物秸秆废弃物可以通过预处理和水解得到以单糖为主要成分的水解液,进而发酵转化为乙醇。目前水解产物中占绝大部分的葡萄糖可以被酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)转化为乙醇,且发酵工艺技术较成熟。但是酿酒酵母在好氧的条件下利用木糖只能进行呼吸代谢途径,不能在厌氧条件下图1毕赤氏酵母 Pichia stipitis木糖和葡萄糖代谢途径将木糖转化为乙醇。以植物纤维素原料中的木糖发酵生产乙代谢葡萄糖复杂得多醇,能使纤维素原料的乙醇发酵产量在原有的基础上增加3树干毕赤酵母发酵木糖的国内外研究成果25%。因此,木糖发酵生产乙醇是决定植物纤维资源生产乙配20世纪70年代国外掀起了一股研究发酵木糖酵母的热经济可行的关键因素潮,研究较多的为树干毕赤酵母和休哈塔假丝酵母。他们主要1发酵木糖的酵母菌种类研究目的为通过改变不同影响条件(如pH、温度、通氧量、培目前有6种酵母菌能通过发酵木糖产生大量的乙醇:树养基成分碳源配比等)来提高树干毕赤酵母发酵木糖生产乙干毕赤酵母( Pichia stipitis)、嗜鞣管囊酵母( Pachysolen醇的乙醇转化率和生产能力。近年来我国也有很多研究者着annophilus)、体哈塔假丝酵母( Candida shehatae)、季也蒙毕手这项研究,他们主要研究目的为通过基因手段来得到发酵赤酵母( Pichia guilliermondi)、酒香酵母( Bretanomyoes)和产木糖理想菌株。朊假丝酵母( Candida utilis)。目前人们研究最多,且具有工1986年, Du Preez研究了pH、温度、底物浓度对树干毕业应用前景的木糖发酵生产乙醇的酵母菌有两种,即树干毕赤酵母发酵木糖50gL的影响结果显示最佳pH4~55,温度赤酵母和休哈塔假丝酵母写为30℃,在此条件下酵母的单位体积乙醇生产速率为09gLh前人大量的研究表明,人们从自然界中筛选得到的能利菌体最快生长速度0.15gh,乙醇得率为043g/g,单位体积的用木糖发酵生产乙醇的酵母菌中,树干毕赤酵母具有很大的乙醇生产速率0.86g1h优势。首先,它不仅可以发酵木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖,而990年,Skog等人研究了通氧量对树干毕赤酵母且可以发酵纤维二糖和木二糖;其次,在发酵的最终产物中副CB6054发酵木糖的影响。培养基成分为50gL木糖67g产物木糖醇较少;再者,培养基中没有维生素B和维生素HYNB,0.81/L K HPO,290g/LKH2PO4;培养条件为pH55,温也可正常发酵,并且它发酵木糖的乙醇转化率较高几乎接近度30℃,空气通量0-09/min。从结果中得知:通氧量为理论值0.518g乙醇/消耗的糖严5nI/L·h时,乙醇得率最大为042g/g,乙醇的生产能力为2树干毕赤酵母发酵木糖的代谢途径020ggh同时当乙醇的生产能力最大时保持通氧量不变,丙对自然界中筛选得到的树干毕赤酵母利用木糖的代谢途酮酸脱羧酶的活性增加苹果酸脱氢酶活性降低。径研究分析发现(见图1,木糖进入菌体细胞后首先在木糖2001年,刘健、陈洪章等人选育出一株优良的木糖发酵原酶(XYL)和木糖醇脱氢酶(XYL2)的作用下转化为木酮菌株树干毕赤酵母菌7124,当木糖发酵条件为24h,28℃糖。木酮糖经过木酮糖激酶(XYL3磷酸化生成5-磷酸木酮。80min0g/L木糖时,乙醇产量为54gL,乙醇得率为5-磷酸木酮糖通过转酮酶(TKT)及转醛生成酵解途径的中间027og产物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛,最后产物16-磷酸果糖2003年 Walkom等人将木糖还原酶、木糖脱氢酶和木和3-磷酸甘油醛进入糖酵解途径产生丙酮酸。最后,在含氧酮糖中国煤化工339经过化学诱变得较低的条件下丙酮酸经丙酮酸脱羧酶(PDC)的催化脱羧变到了成乙醛继而在乙醇脱氢酶(ADH的催化下形成乙醇。另外,当达CNMHGBM30的乙醇产率阳原酶、木糖还原酶和酮氧气充足时丙酮酸还可以通过乙酰辅酶A进入三羧酸途径,糖激酶的活性都要高于TMB33。最终生产CO2。由图1看出树干毕赤酵母代谢木糖的途径比2006年, Agbogho等人研究了不同浓度的葡萄糖和木糖第一期张亚云,等:树干毕赤酵母发酵木糖生产燃料乙醇2009混合物(60g/)对树干毕赤酵母CB6054发酵生产乙醇过程是在各种酶的催化下进行的唯独是保证酶活的重要条件。从中细胞生长速度、底物浓度、乙醇浓度和乙醇得率的影响。从酶反应的动力学来看,温度越高,反应速度和生长代谢也越结果可以看出在高浓度的葡萄糖中培养时,细胞的生长速率快但是酵母细胞内的酶很容易因热而失去活性,通常高温培较快但乙醇的的得率较低;随着木糖浓度的提高,乙醇的转养而的酵母发酵能力差且容易衰老。所以一般温度控制在化率增加,主要是由于菌体利用底物参与了乙醇代谢途径而30-32℃,当温度高于30℃时,乙醇的产量和发酵速率会大不是菌体自生生长。这说明树干毕赤酵母具有发酵高浓度木大降低同时伴随有副产物木糖醇的积累。 Dellweg等人(1984)糖预处理液生产高产量乙醇的潜在力指出,30℃时,发酵参数:发酵时间、菌体生长速率、乙醇转化2007年,宋昕磊张鹏对从自然界中筛选出一株能利用率均达到最大值但是36℃乙醇转化率降至0.29gg。同时温木糖产酒精的菌株1125-3进行发酵性能的研究,研究了不同度低于36℃发酵产物中未检测到木糖醇,当高于36℃时,木条件下自筛菌生长和发酵的规律。自筛菌株定向驯化后对木糖醇含量为295g糖的利用率可达929%酒精得率达1288%菌株1125-3的4.2乙醇和木糖浓度最适生长温度为30℃、pH范围为46-50,最适发酵温度为乙醇对不同种类的酵母的抑制作用有很大差别, Slininger"37℃H为60左右用尿素作为单一氮源自筛菌1125-3的等人(1985研究发现同样条件下树干毕赤酵母CBS5776乙生长和发酵情况良好。自筛菌的混合糖发酵效果优于单纯木醇抑制浓度为39/而CBS5773为57g;温度对乙醇浓度的糖发酵,在2.5%葡萄糖与2.5%木糖做混合碳源发酵时,其酒抑制作用有显著影响, Du preeκ等人研究发现,在1-22℃精得率达到了纯葡萄糖发酵水平时乙醇抑制浓度为44~48g/L;30℃抑制浓度降低了15g/L。同由上研究研究可以看出,树干毕赤酵母发酵木糖生产乙时,树干毕赤酵母CBS5773,25℃乙醇浓度为64g时细胞仍醇的能力离工业化生产还有一定的距离。我们仍有必要对影可生长,30℃明显低于此值;乙醇对细胞生长和酵母发酵的抑响树干毕赤酵母发酵的环境因素进行深入的研究,更好的优制作用也有区别,树于毕赤酵母CBS7126在乙醇浓度32-化发酵条件,提高乙醇得率35g/时细胞停止生长,而乙醇浓度44-47g几L时,乙醇转化4影响树干毕赤酵母发酵的环境因素才受到抑制。前人实验数据表明,乙醇浓度对树干毕赤酵母的41培养基成分、pH和温度抑制作用与酵母种类、培养条件有关;酿酒酵母发酵自身转化培养基成分和培养条件对木糖发酵有很大的影响。树的乙醇抑制作用较外界添加乙醇的抑制作用强,而树干毕赤干毕赤酵母当不添加维生素可以照常发酵木糖,但如果适酵母发酵自身转化的乙醇与外界添加乙醇的抑制作用相当量添加生物素和硫胺素能成倍的提高乙醇产量和乙醇生许多研究表明,木糖浓度对酵母细胞生长和乙醇转化的产能力 151, Gumbel等人1984)研究了培养基成分对树十毕赤抑制浓度不同: Laplace等人(991)发现木糖含量大于40gL酵母CBS5773发酵的影响,结果显示生物素和硫胺素并没有时,树十毕赤酵母CBS5773细胞生长受到抑制,而木糖含量提高乙醇产量和乙醇得率。现在很多研究结果显示营养丰为110gL时,乙醇转化率仍保持在04g,且没有副产物木富的培养基所得的乙醇含量较高于一般培养基,同时酵母膏糖醇形成; Roberto等人(1991)指出木糖含量为76-99g能提高树干毕赤酵母的生长速率啁。时,树干毕赤酵母CBS5773单位体积的生产速率受到抑制,pH主要影响酵母细胞膜所带电荷的状态,从而改变细胞而乙醇转化率在木糖浓度高达145L时未见受到影响;膜的渗透压影响酵母对营养物质的吸收和代谢物的排泄最 Slininger等人(1991)研究发现在高浓度的木糖发酵液中,树干终影响酵母生长和发酵的正常运行。培养基和发酵液的pH毕赤酵母的乙醇转化率高于休哈塔假丝酵母,甚至在200gL改变会引起细胞内部各种酶活性的改变。在环境温度不太高木糖发酵液中,乙醇转化率为036-0.42gg,另外单位体积乙的情况下,树干毕赤酵母可以在偏酸性的环境中生长和发酵。醇转化能力在木糖为100~150gL时达到最大值。但当用酵母来发酵植物纤维水解液时,pH还得适当提高,由4,3通氧量大小于在酸性条件下,水解液当中的醋酸对酵母的生长和发酵抑通氧量大小是影响酵母发酵木糖生产乙醇最重要的制作用加强。前人的研究表明树干毕赤酵母CBS7126的最环境因素,它不仅影响乙醇的转化率和生产能力,而且影响副佳发酵速率pH4~55,pH2.5-6.5之间对乙醇的最终转化率产物木糖醇的积累程度。在高含氧量条件下,树干毕赤酵母通没有太大影响。但 Du Preez(1986)研究表明树干毕赤酵母过三羧酸途径进行有氧呼吸代谢木糖和葡萄糖,产生CO2和CSR-Y633在pH为4-55时乙醇产量由045eg降至生物能量ATP生长菌体,但不发酵木糖;在厌氧条件下会导042geg,pH5时乙醇产量降至0.37g,同时在pH为4~55致许中国煤化工氧量时糖代谢途径才时乙醇最佳发酵速率和产量均达到最大值冈。 Dellweg等人由CNMH(1984指出,在厌氧条件下pH为4时 Pstepit发酵产物中未以途径可以看出,丙酮见木糖醇积累,pH7时木糖醇含量为0.19g。酸脱羧酶和乙醇脱氢酶是乙醇发酵的关键酶。在不同的通温度是影响木糖发酵的一个重要参数,最佳的温度与菌量条件下,树干毕赤酵母诱导产生的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱株的种类底物以及其浓度有关。树干毕赤酵母的生长和发酵氢酶含量差别很大。 Fredlund等人(2004)研究指出在好氧条2009件下丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的酶活较低,在微氧条件下,阝8 TwJeffrise, IV Grigore, J.Grimwood,etal. Genome sequence of其酶活提高了3倍。同时,O2还作为最终的电子接受体来缓 the ligncellulose bioconvert解发酵过程前两步木糖代谢的氧化还原不平衡,但随着含氧 g and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis[]. Nature Biotech量的降低,电子传递系统将无法氧化还原呼吸及发酵过程中nolog,200725:319-326.产生的 NAPDH,细胞内的 NAPDH2增加会降低NAD-木糖 9pc. Du Preez, B Machiel and BA.Prior. Xylose fermentation by Can醇脱氢酶的活性导致木糖醇的积累。因此合适的含氧量对 dida shehatae and Pichia stipitis: effects of pH temperature and酵母发酵木糖至关重要substrate concentration[. Enzyme Microb. Technol, 1986, woL 8, June[10jK.koog, B. Hahn-H? gerda. ERect of oxygenation on xylose fer5展望人们近几十年来通过基因工程手段已获得一些重组菌entation by Pichia stipitis [J] AppL. Environ. Microbiol., 1990株它们在厌氧条件下发酵葡萄糖和木糖的能力得到了提高,(浏健陈洪章,李佐虎木糖发酵生产工艺的研究工业微生物,为植物纤维质原料生物转化生产乙醇奠定了一定的基础,但这些工程微生物本身而言在发酵过程中还存在很多不稳定因2 Wahlbom, WH. vanzyl, L Jonsson, et al.. Generation of th素如乙醇的抑制性乙酸、醛类、酮类等副产物的发酵抑制作mproved recombinant xylose utilizing Saccharomyce用。同时转基因菌株易于污染杂菌环境耐受力较差活力减aeTMB 400 by random mutagensis and physiological comparison弱等缺陷限制了这些菌株工业化应用。ith pichia stipitis CBS 6054 []Ferm Yeast Res, 2003, 3目前,木糖乙醇发酵技术的成功仅限于实验室规模应用,319-326该技术离实际生产还有一定的距离。高成本是利用可再生的[3 Fk.Gbagbo, GC. Kell, MT. Smith, et al. Fermentation of g植物纤维质资源制取乙醇的主要问题之一。未来该领域应在 xylose mixtures using Pichia stipitis U. Process Biochemistry以下几个方面做出更大的努力:从自然界中筛选出发酵木糖200641:23332336能力更强的菌株;优化树干毕赤酵母的培养条件;进一步完善4. Dellweg, MRizz, H Methner, et al. D-xylose fermentation by木糖乙醇发酵工艺。Lett 1984[15JC. Du Preez, M. Bosch and BA.Prior. The fermentation of hexose参考文献][1张字昊,王颉张伟等半纤维素发酵生产燃料乙醇的研究进展门and pentose sugars by candida shehate and pichia stipitis[LMi酿酒科技2004572-74.crobiol. Biotechnol. 1986.23. 228-233.[2mw Jeffries, CP Kurtzman. Strain selection, taxonomy, and genetics [16]DV. Guebel, ACordenons, BC. Nudelet al. 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