代谢工程改善野生酵母利用木糖产乙醇的性能

生物工程学报Chin J Biotech 2008, June 25: 24(6)journals. imaccnChinese Journal of Biotechnology ISSN 100cb@imaccn@2008 Institute of Microbiology, CAS CSM, All rightsresend研究报告代谢工程改善野生酵母利用木糖产乙醇的性能张凌燕12,张梁,丁重阳12,王正祥,石贵阳121江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡2141222江南大学生物工程学院生物资源与转化研究室,无锡214122摘要:从256个自然样品中筛选得到1株可高效转化D木糖的酵母,通过生理生化和分子生物学方法鉴定,证实该菌株是属于 Candidaπ tropicalis,以该酵母为研究对象,增加木糖醇脱氨酶表达量,通过改变代谢流以达到提高酒精产率的目的以pXY212ⅪY2质粒为基础載体,构建了含有潮霉肃抗性的pYX212XYL2 Hygro,电击转化进入野生型C. tropicalis,潮霉抗性筛选,得到含高拷贝木糖醇脱氩酶基因的重组菌梾C.ⅳ tropicalisⅪY2-7.重组菌的比酶活达到o.5υ mg protein,比原始菌株提髙了3倍。实验表明,重组菌木糖醇得率比原始菌株降低了3倍,酒精得率提高了5倍。首次通过实验验证了热带假丝酵母利用木糖产乙醇的可行性,这对研究酵母利用秸秆、麦糠、谷壳等纤维质农业废弃物生产燃料乙醇具有重要启示关键词:热带假丝酵母,木糖,乙醇,木糖醇脱氢酶Metabolic Engineering for Improving Ethanol Fermentationof Xylose by Wild YeastLingyan Zhang, Liang Zhang, Zhongyang Ding.2, Zhengxiang Wang and Guiyang Shi2I Key Laboratory of industrial Biotechnology of Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China2 Laboratory of Biomass Refinery Processing, Jiangnan Universiry, wuxi 214122, chinaAbstract: One yeast strain, which was isolated from 256 natural samples, was found to be able to utilize D-xylose effectively. Onthe basis of assimilation physiological and molecular biological tests, the yeast strain was identified as a strain of Candida tropicalisFurthermore, metabolic engineering breeding strategy was applied to change the metabolic flux in order to increase ethanolproductivity. In this study, the C. tropicalis was used as the host strain and the plasmid pYX212-XYL2, which was formerlyconstructed for over expression of XYL2 gene encoding xylitol dehydrogenase (XDH) from Pichia stipitis, was used as the backboneof the recombinant vector. A hygro gene was inserted into downstream position of XYLa gene, meanwhile, the result plasmidpXY212-XYL2-Hygro transformed into C tropicalis by electroporation. Thus, a recombinant yeast C tropicalis XYL2-7 was obtainedthrough hygromycin B resistance screening and its specific XDH activity was 0.5 u/mg protein, which was 3 times more than thatthe parent strain. Additionally, the recombinant yeast was applied in the fermentation of xylose. Compared with the parent yeast, itwas concluded that the xylitol yield in the broth decreased by 3 times, however, the ethanol yield increased by 5 times. The feasibilityof ethanol production from xylose by C. tropicalis was firstly studied in this paper. These research results are helpful to advance thebioconversion of renewable resources(e. g. straw, wheat bran, and husk )to fuel ethanolKeywords: Candida tropicalis, xylose, ethanol, xylitol dehydrogenaseecelved: January 14, 2008: Accepted: March 12, 2008Supported by: the National Natural Science Foundation of China (No. 20706024),H中国煤化工CNMHGand DevelopmeProgram of China(No. 2007AA10Z.359).Correspondingauthor:GuiyangShi.Tel:+86-510-85918229:Fax:+86-510-85815339:E-mail:gyshi@jiangnan.edu.cn国家自然科学基金(No.20706024)和国家863计划(No.2007AA10Z359)资助张凌燕等:代谢工程改善野生酵母利用木糖产乙醇的性能951我国是一个农业大国,以农作物秸秆、林木枝并产生微量的酒精。以这株酵母为研究对象,在国条为主的农业废弃物资源十分丰富,但并未得到有内首次尝试将天然底物利用策略应用到酵母中效利用,反而对农业生态形成了一定的压力;同时,通过增加细胞内木糖醇脱氢酶的表达量,来减少木我国也是一个能源资源相对贫乏的国家,如何科学糖醇的积累,试图将代谢流引向乙醇形成方向(图1),利用农业废弃物进行能源生产,对于实现可持续发以达到提高乙醇产量的目的。展战略意义重大。近年来利用秸秆、麦糠、谷壳等农业废弃物生1材料与方法产燃料乙醇正逐步成为人们研究的热点。随着木质1.1材料纤维素预处理技术的不断改进和发展,特别近年来11.1样品发展迅速的稀酸预处理、蒸汽爆碎等技术可高效破稍微腐烂的热带水果、花朵、土壤、酒曲、酒坏植物纤维结构,提高微生物的降解转化速率。高醅、热带温泉土、水样等。活力纤维素酶,可利用纤维二糖的重组工业酒精酵1.1.2菌株与质粒母的研究12使木质纤维素原料中纤维素的水解和大肠杆菌( scherichia coli JMI09;PYX212X2高效利用成为可能。因此,微生物本身代谢半纤游离穿梭质粒(含酵母TPI启动子,树干毕赤酵母木维素水解液中各种戊糖底物(木糖、阿拉伯糖等)的糖醇脱氢酶基因)由本实验室先期构建,物理图谱如能力,已成为决定纤维质原料水解液发酵成败的下(图2); pSKsymHyg质粒由本实验室保存;其他质关键粒均在本实验中构建。据报道,酵母菌中有6个种利用木糖发酵产生113培养葚酒精的量相对较大,但这些菌株由于发酵速率慢木糖培养基:D-木糖10g,(NH)2SO45g,且产生大量副产物而不能应用于酒精工业生产。因KH2PO41g,NaCl0.1g,MgS04H2O0.5g,此,人们通过各种育种技术构建能发酵木糖产生酒caCl20.1g,酵母粉0.2g,水1000mL。精的酵母工程菌,即将与木糖代谢相关的酶类的基LB培养基:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠因以及相关的辅酶系统相应的基因克隆到酿酒酵母10g,定容至1L,pH70;用于大肠杆菌培养。固体中,使其能利用木糖产生酒精,郭婷向等将木糖还培养基添加15%琼脂;挑转化子时,加入100gmL原酶基因(XYL),木糖醇脱氢酶基因(XYL2),木酮氨苄青霉素。糖激酶基因(XKS转入工业酿酒酵母获得表达,酒精YEPD培养基:胰蛋白胨20g,酵母粉10g,葡产率提高了12%。 Pitanen'等将XYl、XYL2、XK萄糖20g,定容至1L。固体培养基添加1.5%琼脂,基因克隆到酿酒酵母中,得到重组酵母能利用木糖用于热带假丝酵母培养;添加一定浓度潮霉素产38/L的乙醇B( Hygromycin B)用于重组子筛选。本文从自然界中筛选出一株能高效利用木糖的YEPX培养基:胰蛋白胨20g,酵母粉10g,木热带假丝酵母,该菌能够快速利用木糖生成木糖醇,糖50g,定容至1L。用于酵母培养。NAD(P)HD-xyloseEthanolXylitol图1热带假丝酵母木糖代谢途径围中国煤化工Flg.1 Xylose metoblic pathway in C tropicalis andCNMHGJoumals. im ac cn952ssN10003061cN11-1998/0Chin J BiotechJune 25 2008 Vol, 24 No, 6Bamh I计于600nm处测其吸光度。(2)残糖及发酵产物的分析TPI promoter XYL液相色谱:检测分析用HPLC法( DIONEX P680泵; Agilent1100示差折光检测器; SUGAR SH011色谱柱;流动相为001moLH2SO4、1ml/min;柱12-XYL2046 bp URA selectable Marker温50°C)。12.5常规基因克隆操作方法大肠杆菌感受态制备,外源基因片段与载体连2μ接,简易转化操作,大肠杆菌质粒快速提取,酵母基因组DNA制备等操作参见文献[1l0]。图2质粒PYX212XYL2的物理图谱1.2.6质粒构建Fig 2 Physical map of plasmid PYX212-XYL2以pXY212XYL2为基础载体,该质粒还有酵母12方法TPⅠ启动子,木糖醇脱氢酶基因XYL2,不含潮霉素1.2.1采样与分离抗性片段。由于转化子是进行抗性筛选,必须在该称取5g样品,加到含100mL无菌生理盐水的三质粒中添加潮霉素抗性片段。具体质粒构建见图3。角瓶中,在30℃C下,150-200rmin振荡培养25min;菌悬液用无菌生理盐水进行系列稀释,选择合适的稀释1.2.7潮霉素B的敏感测定度,分别涂布于YEPD平板,30°C培养5-7d,观察菌落收集热带假丝酵母菌体,双蒸水洗涤两次后悬生长情况,并将新长出的形态上有差异的单菌落挑出。浮,30℃进行饥饿培养2~3h。培养后的细胞经适当从初筛YEPD固体平板上挑取典型特征的酵母稀释后涂布于含不同浓度潮霉素B的YEPD平板,单菌落点种在木糖固体培养基上,30C培养48h。30°C培养3-4d,观察生长情况。挑取生长快速的典型酵母单菌落在木糖固体培养基128转化方法试管斜面上划线,4°C保存酵母转化采用电穿孔转化法,转化后涂布于含1.2.2酵母筛选潮霉素抗性的YEPD平板,挑选阳性转化子。种子培养采用250m三角瓶装20 L YEPX培12.9细胞裂解液的制备养基,置回转式摇床,30°C,100r/min,培养24h。摇接种划线分离的酵母转化子单菌落挑入瓶发酵采用YEX培养基,置回转式摇床,30c,50mYE液体培养基,30℃C,200rmin摇床培养100rmin培养至所需时间至静止期。离心收集菌体,用磷酸钾缓冲液洗涤一1.23分类鉴定次,离心后用适量柠檬酸缓冲液重悬菌体。用超声(1)形态与生理生化特征破碎仪(vCX400系列)破碎5min(工作1s停5s),分离物的形态与生理生化特征鉴定,按照文献破壁后高速离心,上清液即为细胞裂解物,用于酶[6]的方法进行。活测定。(2)分子特征1.2.10木糖醇脱氢酶酶活测定山酵母菌DNA的提取方法参照分子克隆实验手木糖醇脱氢酶需要NAD作为辅助因子,催化册。所用引物为真菌通用引物。PCR扩增产物木糖醇生成木酮糖以及NADH,由于NADH在经电泳检测后测序。在核酸序列数据( Gen Bank)中进340m有最大吸收峰,故可通过测量单位时间内酶行同源序列搜索,根据同源序列搜索结果,确定菌催化反应体系在340m处吸光度的增量从而计算株的分类地位。出木糖醇脱氢酶的酶活。酶活单位定义为25C时,1.24分析方法每分中国煤化工皆的酶量(1)生长量测定CNMH Radford法测定取不同发酵时间的发酵液,用721型分光光度蛋白含量。oumals imaccn张凌燕等:代谢工程改善野生酵母利用木糖产乙醇的性能/PI promoter XYLHind illHind il12-XYL2ori-t Col El46 bp URA selectable mark4298bpPstl2HtndⅢIHind IllBamH IXYL2TPI promoteHind IlIri- col EI pYx212-XYL2URA selectable markerT4 DNA LigaseHind IIIoni-fCol El pYX212-XYL2URA图3表达载体pYX212XYL2 Hygro的构建Fig 3 Construction of the expression vector pYX212-XYLz-Hygro2结果与分析株能够以木糖作为唯一碳源生长。逐一经摇瓶发酵初筛中国煤化工示进一步复筛。对21酵母的分离筛选多CNMHG确定一株编号为从自然界中筛选出256株典型酵母菌,其中614412810的菌株能高效利用木糖。954SN10003061cN11-1998/QChin J Biotech008Vol.24No.622分类鉴定数据库进行同源序列搜索的结果表明,菌株2.2,1形本与生理生化特征441-28-1ms的核酸序列,与数据库中已有的菌株41-28-1有典型的酵母菌落形态,细胞短( Candida tropicalis)中序列号为EF196807核酸序列卵形至球形,多边芽殖,所表现出的形态及生理生相似性达到了98%。生理生化特征及其分子生物学化特征表1)与文献[9]的相同。特征均表明,菌株441-28-1的分类地位应属于2.2.2分子生物学特征Candida tropicalis在中国高校工业微生物资源数据rs区域核酸序列的相似性,已经作为确定酵平台保藏编号为 CICIMY0092,它的 ITS rDNA基因母菌分类地位的重要分子生物学依据。对核酸序列的核苷酸序列,在 Gen Bank的登记号为EU121523表1菌株41-28-1的生理与生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of 441-28-lisolateNitrogen-carbon sources Utilization Nitrogen-carbon sources Utilization Nitrogen-carbonD-mannoseGalactitolL-SorboseGalactoseAdonitolMaltoseGlycerolTrehaloseL-rhamnoseMelezitoseD-xyloseDL-lactic acidSoluble starchCellobioseCitric acidL-arabinoseSuccinic acidD-arabinosePotassium nitrateRaffinoseEthanol22.3C. tropicalis CICIM Y002代谢声物分析的表达量,试图将代谢流引向乙醇形成方向,以达从图4可以看出,该株酵母菌代谢木糖的主要到提高乙醇产量的目的。产物为木糖醇,并产生微量的酒精。说明该菌株具2.3.1质粒构建备酒精代谢途径。用 Hind Il酶切 pSKsymHyg质粒,获得13kb的 Hygro片段和29kb的质粒片段。电泳后胶回收13kb的 Hygro片段。将该片段与HindⅢ酶切XylitolpYX212XYL2质粒相连接,获得片段大小为11kb60000的质粒pYX212XYL2 Hygro23.2质粒酶切验证将表达载体pYX212XY2Hygo用 Bamh I和EthanolHind Il双酶切,应释放出不含启动子的17kb的751125i517520XYL2片段,13kb的潮霉素抗性片段,以及8.3kb的pXY212片段。电泳结果与分析结果相同,证明质粒图4 Candida tropicalis CICIMY02木糖发酵液相图谱构建成功。Fig 4 HPLC chromatogram of the broth from Candidatropicalis CICIM YO09223.3潮霉素敏感性实验23代谢工程育种酵母能表达细菌抗生素的抗性基因,它对β-内通过分析木糖代谢产物以及代谢途径可知,中酰胺和其他类似青霉素的抗生素不敏感,但对于氨间产物木糖醇积累,代谢流不能很好地向下进行,基糖fV凵中国煤化工艮他毒素(G418)可能是导致酒精产率低的原因。因此,以筛选到热抗性CNMH泪关。试验比较发带假丝酵母为出发菌株,增加细胞内木糖醇脱氢酶现,当pH8.0的时候,酵母的生长情况与pH70,相Joumals. im ac cn张凌燕等:代谢工程改善野生酵母利用木糖产乙醇的性能955差不大;但对潮霉素B的最低抑菌浓度下降为生成情况进行对比。100ugmL,仅需pH70下的40%。在pH80的条0件下,可以提高敏感度,降低药物使用剂量。0.4kb0.2pYX2120.1Parent strain for xylitol accumulationRecombinant strain for xylitol accumulation图6木糖醇得率曲线Fig 6 Xylitol yield curves0.18图5重组表达载体pYX212XYL2 Hygro的酶切验证Fig 5 Restriction enzyme analysis of recombinant鱼0.14expression vector pYX212-XYL2-Hygro0.l2表2热带假丝酵母对潮霉素B的最低敏感浓度0.06Table 2 Hygromycin B inhibition concentration ofindustrial C. tropicalisStrain Hygromycin B inhibition concentration(ug/mL)pH7.0Parent strain for ethanol accumulationC tropical图6乙醇得率曲线23.4木糖醇脱氢酶牌活的测定Fig 6 Ethanol yield curves将重组载体pYX212XL2 Hygro电穿孔转化法转化进入野生型热带假丝酵母中,通过潮霉素抗性从上图可以看出,原始菌株木糖代谢的主要产平板筛选转化子,重新划线分离后,选取C. tropicalis物是木糖醇,木糖醇得率为06g/g,同时产生微量XYL2-1,C, tropicalis XYL27测定酶活(表3)。的乙醇,乙醇得率为003gg。重组菌株与原始菌株相比,木糖醇积累量只有原始菌株的10%,木糖醇表3重组子木糖醇脱氢酶比酶活得率仅为017gg,乙醇生成量是原始菌株的2倍Table 3 Specific XDH activities of C tropicalis andlis transformants乙醇得率为0.16g/g,提高了5倍。C, tropicalis C, tropicalis上述实验表明增加了细胞内木糖醇脱氢酶的表XY2-7达量重组菌株,能够明显减少木糖醇的积累量,同XDH/(u/mg protein)时乙醇得率也有了一定的提高Protein/(mg/mL)6.7624从酶活测定可以看出,原始菌株木糖醇脱氢酶3讨论XDH)的比活为013umg蛋白,两个重组菌株C.以纤维质农业废弃物为原料生产乙醇,其关键tropicalis XYL21和C. tropicalis XYL27的酶活则分之一就是具有能有效利用各种糖底物,且高效产生别达到03umg蛋白、05 u/mg protein,,分别是原始乙醇的微生物菌种。由于这样的菌种在自然界中并菌株的23倍和38倍。不存人们转向利用代谢τ程原理,通过分2.3.5重组醇母与原始菌株发酵实验比较子遗中国煤化工氏氧条件下高效代热带假丝酵母C. tropicalis与重组酵母c.谢发CNMHG糖的工程菌株3apicalis XYI2-7进行发酵实验,并对木糖醇,乙醇本文从自然界中筛选出一株能高效利用木糖,Joumals. im ac cn956|sSN1000-3061cN11-1998QChin J BiotechJune 25 2008 Vol 24 No 6大量积累中间代谢产物木糖醇,并产生微量乙醇的Northwest Sci Tech Univ of Agri and For(Nat Sci Ed).酵母,菌落外观、细胞形态、生理生化特征及其分2006,34(10):164-177张梁,石贵阳,王正祥,等.酿酒酵母GPD1中整合表子生物学特征均表明,菌株441-28-1的分类地位应达纤维二糖酶基因用于纤维素酒精发酵的研究.西北属于C. tropicalis。在中国高校工业微生物资源数据农林科技大学学报(自然科学版),2006,34(10):164-177平台保藏编号为 CICMM Y0092,它的 ITS rDNA基因[3] Jeewon L. Biological conversion of lignocellulosic的核苷酸序列,在 Gen Bank的登记号为EU21523。biomass to ethanol. J BiotechnoL 1997 56: 21-24[4] Lisbeth O, Hahn-Hagerdal B, Fermentation of lignocellulosic以C. tropicalis CICIMY0092为出发菌株,采用hydrolysates for ethanol production. Enzyme and Microbial代谢工程育种策略,增加细胞内木糖醇脱氢酶的表Technology,199,18:312-331达量,试图使代谢流流向乙醇形成方向,以提高酒[5] Gefferies Tw. Ethanol and thermotolerance in the bioconversionof xylose by yeast. Adv Appl MicrobioL, 47: 222-268精产量。实验结果表明,重组菌株C. tropicalis6]GuoT, Liang DF, Bao Xm. Establishment and ethanolXYL21和C. tropicalis XYL2-7木糖醇脱氢酶的比酶fermentation of a xylose metabolic pathway in an industrialstrain of Saccharomyces cerevisiae. Sugarcane and活比原始菌株分别提高了2倍、3倍,说明木糖醇脱canesugar,2007,3:26-29.氢酶基因在C. tropicalis中成功的得到了表达;发酵郭婷,梁达奉,鲍晓明.工业酸酒酵母木糖代谢途径的实验表明重组菌株C. tropicalis XYL27的中间代谢建立以及酒精发酵初步研究,甘蔗糖业,2007,3:26-29产物木糖醇积累明显减少了,木糖醇的得率降低了切PkmP, tala e, Arstidou A, et al. xylose chemostat70%,同时乙醇产量有了一定的提高。本文以从自然界筛选出的野生酵母为出发菌株glucose, and ethanolmetabolism of the original strain.在国内首次尝试将天然底物利用策略应用到酵母中opl Microbiol Biotechnol, 2005, 67: 827-837.[8]Qu YB. Industrialization of cellulosic ethanol. Progress in并达到了预期效果,即木糖醇积累明显减少,乙醇Chemistry, 29(7):1098-1108的产量也有了一定的提高。初步证明了天然底物利曲音波.纤维素乙醇产业化.化学进展,200,19(7)1098-1108用策略在酵母基因工程菌构建中的可行性。由于[9] Barnett JA, Payne RW. Characteristics and Identification.pYX212XYL2- Hygro质粒是游离于染色体外存在的Qingdao: Qingdao Ocean university Press, 1991在没有选择压的情况下,质粒很容易丢失。进一步巴尼特JA,佩恩著RW.酵母菌的特征与鉴定手册.青岛:青岛海洋大学出版社,1991的工作将通过做外源木糖醇脱氢酶基因在 Candida[10] Adams A, Gottschling DE, Kaiser CA, et aL. Methods intropicalis染色体上多拷贝整合,以获得稳定的重组Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course菌。本文构建的菌株乙醇产量虽有所提高,但提高Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press1998.幅度有限,可以在本文构建的菌株的基础上深入研t1 I Ehrensberger AH, Elling RA, Wilson DK. Structure究中间代谢产物积累与酒精积累之间的关系,并确guidedring of xylitol dehydrogenase cosubstrate定其它可能的限速因素,如木酮糖激酶,辅酶4specificity. Structure, 2006. 14: 567-67[12] Frederick MO, Robert EK, et al. Short Protocol inNAD和 NADPH之间的平衡)等对酵母木糖代谢的Molecular Biology. Translated by: Yan ZY, Wang HL Bei影响,最终解决由于中间代谢产物的积累而导致乙Jing: Science Press, 1998.奥斯博FM,金士顿RE,等.精编分子生物学实验指醇产量较低的问题。这对于利用纤维质农业废弃物南.颜子颖,王海林译.北京:科学出版社,1998生产燃料乙醇具有重要的意义。[13] Liu WF, Zhang XM, Chen G, er aL. Metabolicengineering for improving ethanol fermentation of xyloseREFERENCESse Journal of processEngineering,2006,6(1):138-143[1] Hong JH, Zhang L, Shi GY, et aL. Construction of刘巍峰,张晓梅,陈冠军,等.木糖发酵酒精代谢工程combinant yeast strain using cellobiose as sole carbon的研究进展.过程工程学报,2006,61):138-143.urce. Chin J Appl Environ Biol, 2006, 12(3): 391-394.[14] Hou J, Shen Y, Bao XM. Research progress in cofactor剑辉,张梁,石贵阳,等.利用纤维二糖的酵母工程engineering of xylose metabolism in recombina菌构建.应用与环境生物学报,2006,12(3):391-394中国煤化工:20662[2] Zhang L, Shi GY, Wang Zx, et al. Ethanol fermentationfrom cellulose by expressCNMHG谢工程中辅酶工程的disruption of GPD I in Saccharomy cescerevisiae. J研究进展.中国生物工程杂志,2006,26(2:8994