双氨基聚乙二醇的制备及分离纯化

中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(6)药物制剂、cccccccce-双氨基聚乙二醇的制备及分离纯化刘敏，徐雯，朱叶欢，潘弘，陆伟跃*(复旦大学药学院药剂教研室，上海200032)摘要:聚乙二醇2000经氯代、叠氮化、氢化还原3步反应制得双氨基聚乙二醇(1)粗品，总收率57%。采用阳离子交换树脂，以不同浓度的乙酸盐缓冲液(pH 5.7)梯度洗脱，得到的1纯品采用IR、'HNMR和HPLC等 方法进行检测，并用高效分子排阻色谱法测定相对分子量。关键词:双氨基聚乙二醇;制备;纯化;检测中图分类号: TQ314.2文献标识码: A文章编号: 1001-8255 (2007)06-0423-04Preparation and Purification of Amino-terminated Poly (ethylene glycol)LIU Min, XU Wen, ZHU Ye-huan, PAN Hong, LU Wei-yue*(Dept. ofPharmaceutics, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032)ABSTRACT: The amino terminated poly (ethylene glycol) (1) was obtained from polyethylene glycol 2000 bychlorination, azidation and catalytic hydrogenation with an overall yield of 57%。The title compound was purified usingcation exchange resin with gradient eluent of acetate buffer solution (pH 5.7) of different concentrations. The structureof pure product was characterized by IR, 'HNMR and HPLC. The relative molecular weight of 1 was determined by size-exclusion chromatography.Key Words: amino-terminated poly (ethylene glycol); preparation; purification; characterization聚乙二醇(PEG)是由乙醇单体聚合而成的线形Staudinger法等1911。由于叠氮化物还原法具有成本高分子，结构式为H(OCH2CH),0H。目前广泛用低、反应条件温和、胺化产率高等优点，本研究来修饰多肽、蛋白质、脂质体、纳米粒等药物和载采用该法以PEG 2000为原料，经氯代、叠氮化、体[1-6]。PEG的末端羟基须在较激烈的条件才能与氢化还原3步制备了双氨基PEG(1)，总收率57%。其它基团发生反应，因此必须通过适当方式活化。再利用阳离子交换树脂分离纯化，最后通过IR、可根据不同需要，用醛基、氨基、异氰酸酯基、羧'HNMR和HPLC进行检测，并测定相对分子量。基和烯基等基团取代该羟基7,8]。传统活化方法包1仪器与试药括氰脲酰氯法和羟基琥珀酰亚胺法。其中胺化方法Akta explorer型中压层析系统(瑞典安发玛西亚包括甲苯磺酸酯法、叠氮化物还原法及Mitsunobu-公司): 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);AVATARTM360型傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo.收稿日期: 2006-07-31基金项目:国家自然科学基金(30672545)和上海市纳米科技专项基Nicolet公司); Mercury Plus 400MHz型超导核磁共振波谱仪金(0652m011)(美国Varian公司)。作者简介:刘敏(1969)， 女硕士，讲师，从事高分子药物载体和脂质体给药系统研究。PEG 2000(化学纯，中国医药集团上海化学试剂E-mail: liumin@shmu.edu.cn通讯联系人:陆伟跃(1960)， 男，教授，博士生导师，从事药物靶公司)中国煤化工000、2000、 3350、向传释系统研究。6000|YHCN M H G司);单氨基聚乙二醇Tel: 021-54237040; Fax: 021-641787902000和1对照品(美国Shearwater Polymer公司)。E-mail: wylu@shmu.edu.cn424●中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(6)2方法与结果88%)。2.1 1的制备2.2 1的分离纯化2.1.1试剂的预处理先前的研究中，本试验室已建立了检测1纯度氯化亚砜:氯化亚砜200ml中加喹啉60ml,混的HPLC法2。利用TSK-GELG4000 PW xu凝胶渗匀，放置过夜。过滤，滤液蒸馏，收集约72C的馏透色谱柱上存在的少量荷负电的基团与酸性条件分。所得馏分重蒸馏，收集76~78C的馏分，避光下荷正电PEG的氨基之间的离子交换作用，用低密闭保存。离子强度的流动相洗脱，无氨基取代的PEG 2000乙醇:取镁条2.5 g和碘0.5g置无水乙醇50ml首先被洗脱，单氨基聚乙二醇次之，1再次之。中，80C回流30min。 补加无水乙醇600ml,回流色谱条件如下:色谱柱TSK-GEL G4000 PWxr柱30min后蒸馏，收集78C的馏分，避光密闭保存。(7.8mmx 300mm，10μm)， 示差折光检测器，流动甲苯、二氯甲烷、DMF和吡啶等试剂均经无相5mmolL氯化钠溶液(pH 4.0)，流速0.5ml/min,水处理。柱温25"C， 进样量20μl。 色谱图见图1。购得的2.1.2双氯代聚乙二醇(2)PEG 2000、单氨基聚乙二醇和1保留时间分别为取PEG 2000 80g (0.04mol)溶于甲苯350ml中,21.2、23.6和30.6min, 测得自制的1粗品主峰保留再加入吡啶8ml和氯化亚砜23ml，120C回流2h。时间基本与购得品相同。照峰面积积分法计算，粗反应液冷至室温，过滤，滤液减压蒸除甲苯，冷至品中1的含量为78%。室温。所得黏稠液体中加入二氣甲烷300ml和Al2O33200g(2mol)，搅拌2h,过滤。滤液减压蒸去二氯1000 A甲烷。剩余物滴至冷无水乙醚2.5L中，析出白色8000沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得白色粉末状固体24000.(60g，以PEG 2000计，收率为75%)。R 0.59[展开剂:氯仿-二氯甲烷-甲醇-正丁醇(5:3:3:0.1)，1020040碘蒸气显色]。2.1.3双叠氮聚乙二醇(3)2000.如上所得2 (60g, 0.029mol) 溶于DMF 400ml中，加入叠氮化钠35g(0.54mol)，115C回流2h,冷至室温，过滤。滤液减压蒸除DMF,冷至室/min30温，用二氯甲烷300ml溶解，过滤，滤液浓缩后滴A:购得品，B:自制粗品1-1; 2-单氨基聚乙二醇2000; 3-PEG 2000至冷无水乙醚3L中沉淀，抽滤，滤饼减压干燥，得图1 HPLC图谱白色固体3(52g,以2计， 收率87%)。Rq 0.71[展开剂:氯仿-甲醇-丙酮-正丁醇(8.2:1:1:1.6)， 碘采用UNOsphereTM Q强阳离子交换柱(美国蒸气显色]。Bio-Rad, 25mmx 120mm，100μm)， 用10mmo/L2.1.4双氨基聚乙二醇(1)乙酸盐缓冲液(pH 5.7) 平衡色谱柱。取1粗品3g,将如上所得3(52g，0.025mol) 溶于无水乙醇二以注射用水10ml溶解，上柱。 梯度洗脱[洗脱液氯甲烷(6: 1)混合溶剂300ml中，加10%钯炭3g,A: 10mmol/L乙酸 盐缓冲液(pH 5.7),洗脱液B:室温5atm氢化24h。反应液经0.22μm微孔滤膜抽60m中国煤化工，100min内洗脱滤，滤液浓缩后滴至冷无水乙醚3L中沉淀，抽滤，液从基3m/min。用上述滤饼减压干燥，得白色1粗品(46g,以3计， 收率TYHCNMH(氨基聚乙二醇组分HPLEAwuumw.口口4中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(6)●425●的洗脱液，用氢氧化钠溶液调至pH 9.0，冻干。取1600 1冻干品2g上Sephadex G-15柱，以注射用水为洗脱1200 -液脱盐，收集洗脱液冻干，得1纯品[1.5g, 精制率800 -50%，纯度>95% (HPLC法)]，色谱图见图2。2.3结构表征与相对分子量测定)十1(203002.3.1红外光谱和'HNMRt/mir红外光谱: KBr压片，结果见图3。与PEG1-12000的红外光谱比较，1纯 品图谱中3400cm附近图2 1纯品的色谱图出现-一个弱的宽吸收带，其强度远低于v。u(中等强度)，可能为UN特征峰;两者均在2887cm '出现一等强度; 1114cm 处出现强的尖吸收带为Uo。特征个很强的尖吸收带，即亚甲基的v。:特征峰;另外峰。亚甲基对应的剪式振动吸收带位于1467cm'处，中3p10.0Ai2B ;8.0t9t6.04.02.02t4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500图3 PEG 2000(A)和1 (B)的红外图谱'HNMR:溶剂为重水，样品浓度为10mg/ml, .-CH2-CH2-0- (PEG分子中): 83.3~3.8(多重结果见图4。1纯品，-NH2: 82.9(2H, 三重峰)，峰)。87654321876iB图4 PEG 2000(A)和1 (B)的'HNMR图谱2.3.2高效分子排阻色谱法测定1相对分子量中国煤化工TSKGELG2000照中国药典2005年版附录VH和右旋糖酐20SWx.MHCNMHG0.7%硫酸钠溶液(P88)的分子量与分子量分布项下方法测定1相对(含0.02%叠氮化钠)，柱温35C，流速0.5m/min,。426●中国医药工业杂志Chinese Jourmal of Pharmaceuticals 2007, 38(6)进样量20μ1。1纯品加流动相制成浓度为10mg/ml的各种特征峰都存在，包括C-H的伸缩振动峰、的溶液，作为供试品溶液。另取5个已知分子量的-CH2-的剪式振动峰和C-0-C的伸缩振动峰PEG对照品，同法制成10mg/ml的溶液作为对照品等。'HNMR图谱中，与PEG 2000图谱比较，在溶液。分别进样测定，采用GPC软件(美国Agilentδ2.90处增加了一个三重峰，推断是与-CH,连接的公司，A.02.01版本)将保留时间对对照品分子量线-NH2的化学位移，且含与重复结构-CH2CH2O相性回归，由所得的标准曲线计算供试品的相对分子同的化学位移。HPLC检测结果显示自制1具有与购量。结果表明，1的重均分子量为2045,分子量分得品相同的保留时间，结合分子量等数据，可确证散程度为1.0915。结构。3讨论3.1 1的制备参考文献: .本实验制备1的总收率为57%，粗品纯度为[1] 蒋为民，王妍.蛋白质药物的聚乙二醇修饰[J].微生物学免疫学进展, 2005, 33 (4): 72-75.78%。在制备过程中应该注意以下几点:首先，氯2] 赵蓉,朱家壁.聚乙二醇修饰的立体稳定脂质体[J].国外代反应时加入氯化亚砜后会产生大量沉淀，这些沉医学:药学分册, 199, 26(3): 161-166.淀经TLC检验后发现同样含有2，因此，用二氯甲3] 卞丽红,梅兴国,章扬培.新一代PEG在修饰抗原和药物缓烷尽可能地将沉淀中的2溶解出来与产品合并- -起释中的应用[].生命科学, 2004, 16(5): 296-300.进行处理以提高产率;其次，由于生成的2中可能4] 赵树进,尹亮,郭勇,等.聚乙二醇修饰后超氧化物岐化含有杂质硫，而硫的存在将导致后续氢化还原步骤酶的稳定性及其在家兔体内过程[J].中国医院药学杂志,中的钯炭催化剂中毒，因此在产品中加入活化的氧2003, 23(4): 193-196.化铝以吸附硫及其它杂质。最后，3步反应都是采5] 张宇锋,谢蜀生,侯新朴,等.具有活性羧基末端的长循环脂质体的制备和分布[J].药学学报, 2000, 35(11):用无水乙醚沉淀法得到产品，无水乙醚的用量应至少为浓缩液的8~ 10倍，且冷的无水乙醚沉淀效果6] 付春晓蛋白的聚乙二醇修饰及其在生物医学领域的应用更好。[J].国外医学:药学分册, 200, 28(2): 78-81.3.2 1的分离纯化[7] 董炎明.高分子材料实用剖析技术[M].北京:中国石化出1粗品中的主要杂质为单氨基聚乙二醇、无氨版社, 1997: 80-81.基取代的PEG 2000和少量小分子物质等。阳离子8] 王琴梅,潘仕荣,张静夏.双端氨基聚乙二醇的制备及表征[D].中国医药工业杂志, 2003, 34(10): 490-492.交换树脂是以阴离子交换剂为固定相，借助于样品9] Zalipsky s. Chemistry of polyethylene glycol conjugates中电离组分对其亲和力的不同从而达到分离离子型with biologically active molecules[J]. Adv Dng Deliv Rew,或可离子化的化合物的目的。- 般在阳离子交换树1995, 16(2): 157-182脂骨架上引入的酸性基团有磺酸基、羧基和酚羟[10] Zalipsky s, Gilon C , Zilkha A. Attachment of drugs to基等。在1纯化过程中，首先将1酸化成NH3 -PEGpolyethylene glycols[J]. Eur Polym J, 1983, 19(12):2000-NH3*,根据胺基数目的不同，PEG 2000、单17-1183.氨基聚乙二醇、1在阳离子交换树脂上的吸附性也[11] Zalipsky s, Chang儿L, Albericio F, et al. Preparation and依次增强。用乙酸盐缓冲液梯度洗脱可达到分离纯applications of polyethylene glycol-polystyrene graft resinsupports for solid- phase peptide-synthesis[J]. React Polym,化的目的。1994, 22: 243-258.3.3 结构分析[12] Liu M, Xie C, Xu w, et al. Separation of polyethyleneIR图谱中，理论上-NH,在3500和3400cm^中国煤化工ed derivatives by high-附近有两条弱的吸收带，但由于-NH2在1中所占比例少，不易显现。与PEG 2000图谱比较，该处HC N M H Galgraphy al low ioicStrength wth Tetractive index detection[J]. J Chromatogr A,吸收带的强度显著低于-OH的吸收。另外，PEG2004, 1046(1-2): 121-126.