基于聚乙二醇-聚乳酸-聚乙二醇水凝胶的兔骨髓基质干细胞三维培养

第31卷第6期同济大学学报(医学版)Vol.31 No.62010年12月JOURNAL OF TONGJI UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)Dec.。2010doi: 10. 3969/j iss108 -0392. 2010.06. 006， 基础研究●基于聚乙二醇-聚乳酸-聚乙二醇水凝胶的兔骨髓基质干细胞三维培养孙俊，徐红珍,苏俭生(同济大学附属口腔医院修复科,上海2002)[摘要]目的研究新型可注射温度敏感型聚乙二醇聚乳酸-聚乙二醇水凝胶[ poly ( ethylene glycol )-poly(psilon-caprolactone)-poly( ethylene glycol), (PEG-PCL-PEG, PECE)]的生物相容性,探讨其做为细胞三维培养材料和组织工程支架的可行性。方法将 兔骨髓基质干细胞( bone marow mesenchymal stem cells, BMSCs)接种于水凝胶,体外共同培养后进行形态结构观察,用MTT法检测BMSCs增殖活性,DAPI和EI试剂盒观察细胞存活和凋亡情况。结果BMSCs 在PECE水凝胶中生长及功能均比较理想。DAPVEI染色见少量红色荧光,显示仅有少量细胞凋亡。结论可注射温度敏感性 PEG-PCL-PEG水凝胶生物相容性好,是一种良好的三维培养材料,可作为种子细胞的载体应用于组织工程中。[关键词]水凝胶;骨髓基质干细胞;三维培荞[中图分类号]R24 [文献标志码] A[文章编号] 1008 -0392(2010)06 -0023 -053-dimensional culture of rabbit bone marrow mesenchymal stem cellsin poly ( ethylene glycol ) -poly ( epsilon-caprolactone)-poly ( ethylene glycol) hydrogelSUN Jun, XU Hong -zhen, SU Jian-shen(Dept. of Prosthetics, Stomatology Hospital, Tongji University School of Medicine , Shanghai 200072, China)[ Abstract] Objective To study the biocompatibility of a novel thermosensitive injectable [ poly(ethyene glycol )-poly ( epsilon-caprolactone )-poly ( ethylene glycol), PEG-PCL-PEG ( PECE)]hydrogel and investigate the possibility of PECE hydrogel as scaffold materials in tsse engineering.Methods BMSCs were cultured in PECE hydrogels in vitro , cell morphology was investigated andfunction cell proliferation was observed with MTT method, cell apoptosis were measured by usingDAPI/EI kit. Results BMSCS cells were attached and extended well on hydrogel , cell viabilitywere not affected. DAPI/EI double staining showed litle red fluorescence , which implied smallamount of apoptosis when cells were cultured in hydrogel. Conclusion The injectable thermosensitivehydrogel is of good biocompatibility, and can be used as a scaffold material and the carriers of seed中国煤化工收稿日期: 2010-08 -20基金项目:上海市科委资助项日(0852m03600)CHCNMHG作者简介:孙俊( 1986- ). 男,硕土:研究生. E-mail; sunjun-os@ hotmail. cou通信作者:苏俭生. E-mail: ts197118@ yahoo. com. cn●23.同济大学学报(医学版)第31卷cells in tissue engineering.[Key words] hydrogel; BMSCs; 3-dimension culture传统的细胞培养是二维环境中进行的,其不同1.3 BMSCs的培养与传代于活体内同细胞外基质共同构成的三维立体环境。取1个月龄新西兰大白兔1只,注射空气处死。因此,细胞表现出的生物学行为与体内存在较大差75%酒精浸泡消毒15 ~20 min,在无菌环境下取出四肢异。随着组织工程学的发展,多种新型高分子聚合骨,去除附着在骨上的肌肉,筋膜等软组织,反复用材料被应用于组织细胞的三维立体培养"。水凝PBS与DMEM培养液冲洗,剪去骨两端,用含有适量胶[2是一种能迅速吸收,并保持大量水分而又不溶肝素(625 U/ml)的DMEM液冲洗骨髓腔。获取的骨于水的生物材料,具有三维网络结构,是- -类集吸髓液分别经不同直径大小的注射器针头过滤制成单细水保水、缓释于一体的功能高分子材料,和生物体胞悬液,注人含有等体积Percoll(1.073 g/L)分离液的内细胞外基质相仿。在过去的几年内,水凝胶被广离心管中,离心半径10 cm,2 500 r/min,离心20 min,收泛应用于生物医学领域,包括药物缓释体系构建,移集中间云雾状细胞层,再以LG-DMEM液洗涤细胞,半植材料和组织工程(34)。其中,温度敏感型水凝胶由径10 cm,1000 r/min,离心5 min,重复2遍,去除多余于能感受外界环境微小变化和良好的生物相容性被的脂肪细胞及组织液。加人适量含双抗的10%胎牛血广泛研究[56)。新型温敏型可注射水凝胶( PECE)[7+]清LG-DMEM培养液吹打制成细胞悬液，计数并调整具有生物相容性好、温度敏感性好、成胶速度快、可细胞密度为1x10* L-' ,接种于25 cm2塑料培养瓶中,完全降解降解速度可调控、孔径大小可控、可控释于37 C、体积分数为5%的CO2饱和适度条件培养箱生物活性大分子等优点。本研究采用BMSCs与中培养。48 h后首次换液,弃去未贴璧或已死去的细PECE进行三维立体共培养,研究水凝胶的生物相胞,以后每3d换液- ~次。至10~12 d贴壁细胞融合为容性,以探讨其构建三维培养基及作为组织工程支单层时,用胰蛋白酶按1:2消化传代。1.4 细胞的三维培养架的可行性。将25 ml培养瓶中传至第3代的细胞用0. 25%胰1材料与方法酶消化后转人离心管中，以半径10 cm,1 500 r/min离心10r/min,弃上清,用液态水凝胶将细胞吹打混1.1 试剂及仪器.胰蛋白酶( Hyclone公司),胎牛血清( Gibco公匀,备用。将10%培养基于37 C水浴锅中预热,置于培养皿中,迅速将吹打混匀的细胞与水凝胶混合物滴司)、RPMI-1640培养基(Gibco公司), MTT试剂人培养皿中然后置于37 C、5% CO2培养箱中孵育,( Sigma公司) ,CO2培养箱( New Brunswick Scientific用倒置相差显微镜观察细胞在材料中的生长情况。公司) ,倒置相差显微镜( Nikon) ,Microplate Reader1.5 MTT法检测ModeBS0 (BIO-RAD公司),荧光显微镜,超净工作当细胞长至80%满时,用0. 25%胰蛋白酶消台(苏州净化仪器厂) ,96孔平底型培养板(Costar公化,吸管反复吹打制成单细胞悬液,调整细胞密度为司) ,细胞计数板等。5x 10*/ml,以100 μ/每孔接种于96孔板,即细胞1.2 水凝胶材料制备密度为5x10'/孔,置于37 C、5% CO2培养箱中孵本实验所使用的聚乙二醇聚乳酸-聚乙二醇水育。6h后实验组按不同组别分别加入含DECE水凝胶(PECE) ,由同济大学先进材料与纳米生物医凝胶10~50 μ/ml的培养基,每组设6个复孔,对学研究院提供。PECE 是一种新型可注射的温度敏照组不加水凝胶边缘孔用无菌PBS填充,继续在感性水凝胶,孔径为6~11 um, 37 C为其临界温37C5垃美第中孵夯10 h待细胞贴壁汇中国煤化工度,当温度达到37 C时,60 s内水凝胶将转化为固合成MYH加入5 mg/ml的态,当温度低于或超过37C时,水凝胶将逐渐转化MTTCN M H Gg培养液后，每孔为液态。加入二甲基亚砜(DMSO)液150 μ,室温下于微孔第6期孙俊等:基于聚乙二醇-聚乳酸聚乙二醇水凝胶的兔骨髓基质干细胞三维培养板振荡器上振荡10 min,使结晶物溶解,在酶标仪上选择波长490 nm检测各孔的吸光度值(D) ,结果以OD实验组/OD对照组表示。1.6 DAPI和EI法检测细胞凋亡情况将PECE水凝胶和BMSCs共培养48 h后,用PBS液洗涤2遍后制成5x10*/ml的细胞悬液,按围2 BMSCs 在PECE水凝胶中的相差显微團( x200)DAPI和EI试剂盒说明依次进行染色,，在荧光显微可见长梭形BMSCs被包含在PECE水凝胶中镜下观察细胞凋亡情况。Fig.2 BMSCs in PECE hydrogel under microscopy( x200)1.7统计学处理所有数据均用x ts表示,用SPSS14. 0统计软1件行单因素方差分析( ANOVA),P <0.05为有统.8 1计学意义。6↓0.6 12结果.4-.2 t2.1 BMSCs 的培养与传代倒置显微镜下观察分离出的BMSCs形态呈圆l020 30400PECE浓度(μm)形,约72h后绝大多数细胞贴壁,细胞形态为梭形、多角形(图1a),7 ~10 d可达80%融合,此时细胞呈图3 PECE 水凝胶对BMSCs增殖活动的影响Fig,3 Cell vibility when cultured with PECE hydrogel长梭形,传代细胞较原代细胞成长快(图1b),5 ~7 d基本铺满瓶底。2.3细 胞凋亡情况DAPVEI双重染色后在荧光显微镜下观察,可见细胞布满整个视野。大部分细胞形态规则,发出蓝色荧光,仅有少量红色荧光。48 b后, BMSCs细胞能够在水凝胶构建的三维环境中存活和增殖,极少数细胞凋亡(图4)。图1 BMSCs 培养Fig.1 Culture of BMSCsa:72h(x100);b: I周( x100)BMSCs与PECE水凝胶复合生长情况BMSCs细胞在培养基中培养,贴壁生长良好。传至第3代时,约铺满80%瓶底,用倒置相差显微镜观察,细胞图4 DAPV/EI 双重染色检测细胞凋亡情况被包裏在凝胶内,大多呈现圆形或梭形(图2)。3dFig.4 Cell apoptosis after DAPI/EI staining of后,大约70%水凝胶降解,在培养皿底部可以看见endothelial cells in bhydrogel部分贴壁细胞,这可能是水凝胶降解后所释放出蓝色荧光表示存活细胞,红色荧光表示凋亡细胞来的。.3讨论2.2细胞增殖能力测定MTT法用来研究水凝胶对BMSCs细胞活性的骨髓基质干细胞( bone mesenchymal stem cells,影响(图3)。结果表明,当100 μl细胞溶液中加入BMSCs)县日前号细 织T程帚有临床应用前景的种水凝胶在10~50μl之间时,实验组和对照组的吸子细中国煤化工容易体外培养光度比值均在1左右,统计学分析显示水凝胶对细时增死;YHC N M H G达成骨细胞表型、胞增殖能力没有显著的影响(P>0.05)。植入体内可保持成骨活性等优点。在本研究中,它●25 .同济大学学报(医学版)第31卷被用来检测新开发的水凝胶作为组织工程材料的可PECE网络状的聚合物链具有高度溶胀功能,弹性行性。类似天然组织,它的网状结构有利于氧气、营养物质在大多数体外细胞研究中,细胞都是在二维的以及其他水溶性代谢产物的交换。它的聚合物能够培养皿或玻片上生长的,当细胞在二维环境培养时,在低于37 C时呈溶液状态,有利于生长因子,细胞它们的代谢基因表达模式、胞外基质蛋白的表达以以及其他生物活性分子进人其中而成为混合体,而及形态学都会发生改变,这种二维培养模式并不能达到适当的温度时,它将转变成为固态,产生类似于反映细胞在体内环境的生物学功能。细胞外基质的作用。在本实验中,当温度低于37 C正常细胞的三维环境构成-个复杂的网络,细时,水凝胶逐渐转化为液态,作为一-种细胞载体,能胞外基质( extracellular matrix, ECM)创造各种有利够将细胞、细胞外基质以及参与血管形成过程的--于细胞生长的局部微环境。细胞外基质的主要成分些调控因素如激素、生长因子、各种药物等构成-一个是胶原、弹力纤维、蛋白聚糖、糖蛋白等,ECM不仅有机整体,当温度达到37 C时,60 s内水凝胶将转是细胞分泌代谢的产物,而且对细胞功能有重要的化为三维立体固态结构,从而使实验结果能更加真调节作用。随着组织工程技术的发展与完善,国内实地反映活体组织中的生物学特性。外学者开始利用生物材料创造一个类似于体内微环本研究结果显示，新型可注射的PECE温度敏境的三维结构。细胞三维培养-方面能够 为体外培感性水凝胶对BMSCs细胞的增殖及凋亡和相关功养细胞提供与其组织来源相似甚至相同的细胞生长能均无明显影响,能够作为细胞外基质为细胞提供微环境和细胞联系,从而既有利于各类细胞的分化必要的营养和屏障保护作用,BMSCs细胞在这种水定向诱导,又有利于细胞分化表型的维持和增殖;另凝胶中生长良好,增殖、分泌等功能不受影响,该水-方面可望在体外构建与各类组织、器官相应的细凝胶能为细胞生长提供-个很好的 三维微环境,可胞三维生长类似物或等同物。其中生物材料是细胞以作为构建三维细胞培养基的基础材料。附着的基本框架和代谢场所,其形态和功能直接影基于水凝胶的优良性能,构建三维细胞培养基响所构成的组织形态和功能,是组织工程中的关键。的难题仍有很多难题,如组织的内源性因子必须在生物材料为细胞的停留、生长提供三维空间和新陈凝胶里全面的体现,必须制定更好的方法把这些因代谢的环境,并决定新生组织器官的形状和大小，与子在合适的时间以合适的顺序导人正确合适的位单纯的细胞培养基相比具有明显的优越性'9]。置。随着组织工程的发展,基于水凝胶的三维培养此外,理想的支架材料需要满足几个方面的要体系的建立以及水凝胶支架是十分有前景的。求:(1)合适的表面化学性能以利于细胞黏附、分化及增生;(2)适当的降解率,无害的降解产物;[参考文献](3)无细胞毒性;(4)足够的机械强度;(5)最小的免疫及炎症反应;(6)生产.纯化及加工的简单性; [1] Ho E, Lowman A, Marcolongo M. Synthesis and(7)满足组织的连接及血管化的孔洞。目前组织工characterization of an injectable hydrogel with tunable程细胞最常用的支架材料之一是智能水凝胶材mechanical properties for soft tssue repair [ J].Biomacromolecules, 2006,7: 3223 - 3228.料10]。它是一种能迅速吸收及并保持大量水分而又不溶于水的低交联度材料,具有高分子电解质特[ 2 ] Melinda C, Cushing S,Kristi s. Hydrogel Cell Cultures[J]. Science, 2007 ,316: 1133 - 1134.性和三维立体的网络结构,自身能感知外界环境[3] Wei x, Gong C, Gou M, a al. Biodegradable poly(如温度、pH值、光、电、压力等)微小的变化或刺(pilon-caprolactonc)-poly( ethylene glycol) copolymers激,并能产生相应的物理结构和化学性质变化。as drug delivery system [J]. Int J Pharm, 209 ,381本实验所使用的水凝胶是一种温度敏感性的水中国煤化工凝胶,当温度低于或高于体温37C时,PECE水溶[4]r al. Bidegradble液显透明状态,具有流动性;在温度为37 C时，YHc N M H GL.PEG hydrogel forPEG-PCL-PEG水溶液显透明固体态,失去流动性。bFGF anigen delivery to improve humoral inmunity.26●第6期孙俊等:基于聚乙二醇聚乳酸秦乙二醇水凝胶的兔骨臂基质干细胞三潍培养[]. Growth Factors, 2009 ,27(6): 377 -383.[8] GongCY, Shi s, Dong PW, et al. Biodegradable in[5] Yang B, Gong C, QianZ, et al. Prevention of post-situ gel-forming controlled drug delivery system basedsurgical abdominal adhesions by a novel biodegradableon thermosensitive PCL-PEG-PCL hydrogel; part 1-thermosensitive PECE hydrogel [J]. BMC Biotechnol,synthesis , characterization, and acute toxicity evaluation2010,10(1): 65.[]. J Pharm Sci, 2009 ,98( 12) : 4684一4694.[6] Liu CB, Gong cY, Huang MI, et al. Thermoreversible[9] Criffth LG, Naughton G. Tissue engineering curentgel-sol behavior of biodegradable PCL-PEG-PCLchallengesand expanding opportunities [ J]. Science,triblock copolymer in aqucous solutions [J]. J Biomed2002 ,295: 1009 - 1014.Mater Res B, 2008,84: 165- 175.[10] GongCY, Shi s, Dong PW, et a1. Thermosensitive[7] Hwang M, Suh JM, Bae YH, et al. CaprolactonicPEG-PCL-PBG hydrogel contolled drug delivrypoloxamer analog: PEG-PCL-PEG [J]. 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