乙醇氧化酶法测定血清中乙醇含量

208临床检验杂志2002年第20卷第4期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Science2002No.20No.4文章编号:1001-764X2002)40208-03中图分类号R446.1文献标识码乙醇氧化酶法测定血清中乙醇含量王向陬嵊州市人民医院检验科浙江嵊州312400摘要:目的建立血清中测定乙醇浓度的乙醇氧化酶法。方法基于乙醇氧化酶氧化乙醇产生乙醛和HO偶联 Trinder反应生成醌亚胺,可在500m波长比色测定通过优化反应体系中各主要成分和测定条件建立了本法。结果本法的灵敏度0.5g/L时Asmn1m>0.08;线性范围0.125~5.0g/L.批内CV为1.02%,批间CV为2.76%本泫Y卢气相色谱泫ⅹ沘较;}=1.06Ⅹ+0.12,=0.989。结论本法的灵敏度较高、线性范围宽、精密度和准确性均较好适合临床实验室急诊测定用关键词乙醇血清氧化酶法医院急诊室遇疑似急性酒精中毒的患者或交通2.5测定方法自动分析的主要参数如下反应类管理部门遇疑有酒后驾车的对象常常需要测定血中型两点法反应温度:3℃波长:500nn(主)600乙醇浓度。血清冲乙醇浓度测定早期用蒸馏氧化mn次)样本6团加R1240μ孵育3-5min后法和渗透压法特异性差20世纪50年代开始用醇加RⅡ60l加入RⅡ后延迟1min第一点读数,脱氢酶法测定60年代报告用气相色谱测定。我们再过4min第二点读数。建立了用乙醇氧化酶(ALO)测定血清中乙醇含2.6比较方法气相色谱法1标本用血清。量的方法其灵敏度、准确度和线性范围均较好现3实验结果报告于下。3.1缓冲液种类和pH选择乙醇氧化酶较适用的原理缓冲系统为磷酸盐和Tis,我们用它分别配成血清中乙醇经ALO催化生成乙醛和H2O2,7.07.58.08.59.0五种不同pH的缓冲液离子强后者经 Trinder反应生成红色醌亚胺于500m波度均为100mo/L按应用试剂加入其他成份分别长比色对照标准可计算出乙醇含量反应式如下用一份5g/L的标本测定结果磷酸盐缓冲液在pHALOD7.5和80时吸光度最高,lis/HC缓冲液在p8.5CH3 CH2OH +0CH3CHO+H202时吸光度最高。为了照顾到PO的最适pH和pH稳定性我们采用pH7.5的磷酸盐缓冲液。HO2+4AF+酚0红色醌亚胺+4o3.2ALOD的活性浓度选择分别配制ALOD浓度为500U/L4000U/L,1500U/L和2000U/L2材料和方法21试剂乙醇氧化酸 from Candida sp.),本305.0g/L的标本结果说明酶浓度越高反应速Asahi Chemical Industry公司产品辣根过氧化物酶率越快但在1000U/L时,三个浓度的标本在5Roche公司产品;-氨基安替比林、酚和磷酸盐均为国产分析纯min内吸光度均呈直线性且有较高的吸光度故选择此浓度2.2仪器 Hitachi7170自动生化分析仪Beckman du640分光光度计2.3应用试剂组成RⅠ:苯酚10mmo/L,磷酸0.30盐缓冲液100mmol/L,pH7.5;RⅡ:ALO5000U/LPOD1000U/LA-AAP2mmo/L。校准物为1g/L无水乙醇溶液000L2.4校准物用分析天平精确称取无水乙醇1gλmm)移至1L量瓶中加去离子水到刻度混匀及时用安瓿1m分装图1本法的吸收光谱扫描结果临床检验杂志2002年第20卷第4期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Sciene3波长选择一个1.0g/L的标本,用本法测人(0.07~0.15g/L均否认饮酒。另33人均最终定显色后用 Beckman DU640分光光度计扫描结承认饮过酒,血清中乙醇浓度在0.55~2.42g/L,果见图1。吸收峰在500m处次波长选用600平均1.59g/Lnmlo5讨论34反应动力学曲线选择1.0g/L3.0g/L和1976年 Hadjiioannou等4用脱氢酶法在自动5.0g/L的标本,分别用本法测定,观察反应动力分析仪上测定全血、血清和尿中乙醇含量。为了提学結果见图2,说明三个标本在反应时间5min)高灵敏度Jung等5在醇脱氢酶的基础上再偶联醛内均呈直线上升脱氬酶这样1分子的乙醇可产生2分子的NADH。Kapur等6在醇脱氢酶基础上偶联黄递酶使IT3.0g/L还原成甲在可见光比色以提高灵敏度。我们建立的氧化酶法有较高的灵敏度用两点法测定浓度为0.5g/L时A50mm>0.08。精密度较好批间CV为2.76%,且和气相色谱法有良好相关适合各种类型的自动分析仪,临床实验室测定非常方便。0血清中乙醇浓度达到0.5-1.0g/L时可出现0100200300400500600()酒醉的各种症状如脸红、健谈、反应迟钝、视觉变差因此欧美将血清中乙醇含量≥0.5g/L作为酒图2本法的反应动力学曲线后驾车的标准。3.5线性范围取混合血清1份加入无水乙醇至血清中乙醇浓度>3.0g/L时中枢神精系统严5.0g/L然后再用同一混合血清稀释至4.03重损害可出现昏迷,>4.0g/L时可导致死亡。本2.01.0.50.25和0.125g/L8个浓度用本法法的线性范围为0.125~5.0g/L急诊检测已足测定按 NCCLS EP6P文件作线性评价2]线性回够。归方程为Y=0.9864X+0.0045,n=0.991。稀正常值测定时有不到半数的标本可测出微量的释变异0.08 for 0. 5 g/L of ethanol the linearity was 0. 125-5.0 g/L; the precisions were1. 02% for within-run CV and 2. 76% for between-run CV. Correlation between the reasults obtained by this method Y )and gaschromatographic method(X)was Y=1.06X+0 12 /=0.989. Conclusion This method had higher sensitivity wide linearitygood precision and accuracy. It is suitable to use for the emergency test of clinical laboratorieKey word ethanol assay i ethanol oxidase method稿日期200109-19修回日期20020527)本文编辑陈维忠)文章编号:1001-764X2002)40210-01中图分类号:R446.3文献标识码3流式细胞术白血病免疫分型中CD45设门的重要性巩文玉(首都医科大学附属北京儿童医院血液中心北京10005)关键词流式细胞术白血病免疫分型免疫分型在急性白血病的诊断中起着重要作用它具有在白血病细胞膜上抗原的交叉表达和/或缺失现象很特异性强、客观等优点从而降低了急性白血病形态学的误常见有些交叉是白血病细胞所特有的成为运用FCM检测诊率。但也应注意到所用的试剂质量、标本处理及染色方微小残留病灶的依据2但系统误差的存在同样会产生类法等对结果会产生很大的影响如不进行监测有可能导致结似结果假阳性或假阴性)此时,只要在成熟淋巴细胞和成果的失真。本文就流式细胞木 flow cytometry FCM)血病熟粒细胞上不存在相同的抗原交叉这种表型结果就是可信免疫分型中CD45设门的重要性谈些体会的否则就要认真查找原因。值得指出的是正常细胞本身运用FCM检测白血病细胞免疫表型普遍采用CI45/也存在着抗原的交叉如CD10在成熟粒细胞以及CD5在BsC双对数散点图( dot plo)对幼稚细胞设门来分析其抗原淋巴细胞某一发育阶段上的表达341这种情况并不说明试表达情况。白血病标本在CD45/sSC双对数散点图上一般剂质量或样本处理方法有问题只是这种正常交叉表达的抗可见到三群细跑即成熟淋巴细胞、成熟粒细胞及幼稚细胞,原并不是很多。它们之间相对位置固定不变。对这三群细胞分别设门可以综上所述FCM白血病免疫分型结果的室内质量评估观察其各自抗原的表达情况。成熟淋巴细胞中大部分为T的关键在于识别岀成熟的淋巴细胞及成熟粒细胞而CD45淋巴细胞B淋巴细胞占一小部分因此此群细胞主要表达设门技术为此提供了一个强有力的手段。在我院检测的急CD5、CI、CI等T细胞抗原同时也应有少部分细胞表达性白血病标本中绝大部分标本均能检测到或多或少的成熟Ⅰ33、CD15、MPO等髓细胞抗原。这两群成熟细胞为白血100%的标本这说明上述方法是确实可行的。抗CD45单抗病免疫分型结果的室内质量评估提供了极有价值的依据。也因此成为此项工作中必不个试剂冲情况是成熟淋巴细胞的CD5、CD7、CD19、CID20阳性率参考文献极低或根本无细胞表达此种情况很可能预示着质量失控。[1] Lanza f, Latorrace A, Moretti,eal. Comparative analysis ofD3、CD3、MPO也是如此。另一种相反情况是淋巴细胞fferent permeabilization methods for the flow cytometry抗原不仅在淋巴细胞上表达,在成熟粒细胞上也表达measurement of cytoplasmic myeloperoxidase and lysozyme inCD13、CD33、MPO不仅在粒细胞上表达在成绩淋巴细胞上normal and leukemic cell[J]. Cytometry 1997 30(3): 134-144也出现。这两种情况一般提示免疫分型结果的不可靠需要2 Czuczman Ms, Dodge R K, Stewart Cc,na. value of查明原因重新检测。前者要注意试剂的效价、有效期及细胞浓度等因素后者要注意标本处理方法是否得当尤其在eukemia: cancer and Leukemia Group B Study 8364[ J Blood999311)3931-3939检测胞质内抗原时渗透剂选择不当或方法不合适非常[3 Joken MR Shal VODattilio K L. et al. Flow cytometric analysis易造成假阴性或假阳性结果。 francesco等1)三种不同的of human bone marrow ll Normal B lymphocyte developmen[ J]渗透剂检测了MPO及溶菌酶这两种粒细胞颗粒成分在淋巴Bod198775)1316-1324细胞中的表达情况其结果是经其中两种渗透剂处理的正常4] Verstappen L. W, Huang s, Picker I.J,eal. Flow cytometric人淋巴细胞的MPO阳性率分别为58.6%、54.0%溶菌酶ssessment of human T-cell differentiation in thymus and bone