桑黄多糖的提取工艺

科学研究食品研究与开发2009年12月B第3卷第12期桑黄多糖的提取工艺戈延茹,曹恒杰,张晓兰,卞炯,姜树红,吉顺莉,张春燕(江苏大学药学院,江苏镇江212013)摘要:筛选出桑黄多糖最佳提取工艺。采取正交设计试验优选桑黄多糖提取工艺;通过对醇沉法、壳聚糖吸附法的比较,选出最佳精制工艺。桑黄多糖最佳提取工艺为:按1:14的料水比进行浸泡12h,然后在100℃恒温下,进行30min超声提取,重复提取3次。精制方法采用壳聚糖吸附法。关键词:桑黄;多糖;正交设计;含量测定TUDY ON THE OPTIMUM EXTRACTION AND PURIFICATION TECHNOLOGY FOR POLYSACCHARIDES FROMPHELLINUS IGNIGARIUSGE Yan-ru, CAO Heng-jie, ZHANG Xiao-lan, BIAN Jiong, JIANG Shu-hong, JI Shun-li, ZHANG Chun-yan(School of pharmaceutical science, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu, China)Abstract: Choose the best preparation of the Phellinus igniarius polysaccharide. The best extraction method ofthe polysaccharide was determined by orthogonal design; Through the compare of the ethanol extraction andchitosan absorbing purification, choosing the best extraction method. The best extraction method of thepolysaccharide of the Phellinus igniarius was: At first, the Phellinus igniarius was soaked in water about12 hours, and then when the temperature of extraction was 100 C, the solvent-water and the material is 14: 1extract 3 times during 30 min in supersonic wave. The chitosan absorbing purification was used to extractpolysaccharide. Conclusion: the Phellinus igniarius polysaccharide extracted through the best method was verypure, and the proportion is 1.46 % which means that extracting 1.46 g pure polysaccharide of the phellinus作者简介:戈延茹(1960-),女(汉)教授博士在读,从事中药制剂与质量控制技术研究。而且上下波动,没有明显的抑制或激活效果,参照数据钼酸铵则是比较理想的激活剂。总体上看,它不属于抑制剂。钼酸铵对醛脱氢酶的抑制效果较为明显,是一个抑制剂,抑制效果随其浓度的参考文献:增加而逐渐增加,但是,在0.5%-0.7%之间的抑制强[江波涛,黄玉贤,孟淑珍,等牛奶保鲜的几种方法门畜产品加度较强,从总体上看,它的抑制效果比较稳定,没有上工,1997,12(6:57下波动。2]王敏常喝牛奶好处多四川奶业,2007,2(2)233]孙继明杨新春黄嘌呤氧化脱氢酶与心血管疾病中华老年心脑血管病杂志,20066(6:63结论4]皮付伟近红外光谱技术在牛奶体细胞奶酪和奶粉成分中的应牛奶中醛脱氢酶的最适温度为35℃;最适pH为用研究J食品工业科技,200,(10):15370;最适底物浓度为05%。相应的动力学参数Km=巧韦莉莉水牛奶乳酸脱氢酶同工酶研究广西农业科学,95,300063moL,vmax=00360Dmin。因此,其动力学中国煤化工的影响中国杜区医方程为:V= 0.0361sL-(U/min)7]吴CNMH龙江略东滨地图出版0063+社,2002:146硝酸钙和硫脲是比较理想的抑制剂,而硝酸钾和收稿日期:20007-102009年12月第30卷第12期食品研究与开发科学研究igniarius per 100 g crude drug.Key words: Phellinus igniarius; polysaccharide; orthogonal design; the determination of the content桑黄是一种珍贵的药用真菌叫研究发现桑黄含有加适量去离子水溶解,转移至100mL容量瓶中,加水多糖、甾醇类物质、三萜类芳香酸氨基酸、酶和黄酮至刻度,摇匀配成浓度为0106g的标准葡萄糖溶等多种成分,具有极高的药用价值如抗癌、抗纤维化、液备用。增强免疫力、抗血管增生、降血糖等吲。目前国外特别2.2.25%苯酚试剂的配制是韩国和日本对其研究的很多,其抗癌效果显著,是取苯酚100g,加铝片0.1g和 NaHcO3005g,蒸一种极具开发价值的珍贵药用真菌;而桑黄无毒副作馏,收集182℃馏分称取75g加去离子水150mL溶用因此也是开发保健食品的重要原料明。桑黄不仅可解,置棕色瓶内备用。以用于制药和生产健康食品,还可做为养颜、抗皱、防223标准曲线的制作衰老的活性成分添加到护肤保健产品中。精确量取上述葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.40.6多糖在抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、降血糖、抗病08、1.0mL,置于干燥洁净试管中,分别加去离子水使毒等方面具有重要活性作用,而多糖是桑黄的主要成其成1.0mL,再分别加入5%苯酚溶液20mL,摇匀;分,为了很好的利用这一宝贵资源,本试验对桑黄多然后加人浓HSO470mL,充分摇匀,室温放置25min糖的提取精制进行了进一步的研究。在490nm波长处测定吸光度值,同时做一空白试样以吸光度值对葡萄糖浓度做线性回归,得回归方程为:1仪器与试剂Y=0072017X+0022317(r=09994,n=6),葡萄糖在11仪器1.0mg/L~100mg/的范围内呈现良好的线性关系。UV-7502PC紫外可见分光光度计:上海欣茂仪器有限公司;真空干燥箱:江苏东台电器厂;KQ-250B3桑黄多糖提取工艺的选择型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;HH-S数3.1制定考察因素和水平间显恒温水浴锅:江苏省金坛市医疗仪器厂;SHZ-DⅢ循根据文献调研及数理统计设计正交试验方案,以环水式真空泵:巩义市英峪予华仪器厂;电动搅拌器桑黄多糖粗得率为考察指标进行试验,当采取水提取电机:金坛市中大仪器厂; BUCHI Rotavapor R-200&时,提取温度(A)超声时间(B)料液比比值(C)对试BUCHI Heating Bath B-490减压蒸馏仪;H605超声验结果有影响所以本试验采用这三者作为因素各取清洗机:无锡市超声电子设备有限公司;80-2离心沉三个水平进行正交试验。因素水平见表1,正交试验结淀机:上海跃进医疗器械厂;DL-5低速离心机:上海果见表2,方差分析结果见表3。AN Ting科学仪器厂;电子天平 Sartorius Ltd;切片机表1因素水平表系列、中药粉碎机:上海淀久中药机械制造有限公司。Table 1 Levels of factors1.2材料与试剂水平温度超声时间min料液比/gg桑黄(吉林延吉);壳聚糖:浙江永跃海洋生物有Levels Temperature/C Ultrasound time/min Liquid-solid ratio限公司;葡萄糖(AR):中国医药集团上海化学试剂公司;其它试剂均为分析纯。l:14表2正交试验结果2含量测定Table 2 Results of orthogonal test21多糖的含量测定方法CD空列y%硫酸-苯酚法是根据多糖在浓硫酸水解作用下产生单糖,并与苯酚发生显色反应的原理测定多糖浓度,中国煤化工490mm处吸收值与糖含量呈线性关系。22制备标准曲线CNMHG221葡萄糖标准溶液的配制精确称取干燥恒重(10℃)的葡萄糖00106g,科学研究食品研究与开发2009年12月第30卷第12期续表2正交试验结果4桑黄多糖精制工艺的选择明ontinue table 2 Results of orthogonal test41桑黄的提取与含量测定称取桑黄约100g按最佳提取方案提取,重复提I%584614622681取3次,提取液过滤,合并滤液浓缩至约400mL将其6.17倒入500mL的容量瓶中,定容,摇匀备用;从中吸取3份提取浓缩液,每份10mL,置于100mL容量瓶定容Ⅱ禅蜘/%2057231720302.113后摇匀;精确吸取1mL至25mL容量瓶内,定容即得%2.4632.103水提浓缩液供试品。用22.3的方法测其吸光度值,如05160.27003330.187表5所示。注:指标y选择为粗多糖得率的多少。由表2正交试验结果和极差分析可知影响桑黄表5桑黄粗多糖得率表Table 5 Yield of Phellinus linteus ribble Polysaccharide table粗多糖提取诸因素的主要顺序为温度(A)料液比(C)、编号吸光度浓度(myL)粗多糖得率%平均值/%超声时间(B);确定最佳工艺条件为ABC3,即桑黄粉N. Absorbance concentration/(mgy)Yid% Average val碎过筛后,按1:14(gig)的料液比进行浸泡12h,在10.208257832D.197100℃恒温下,进行30min超声提取,最后进行过滤提2.1630.19123423取滤液;重复此操作3次,合并滤液进行浓缩后精制。注:W=1003300g丧3方差分析表Table 3 Analysis of variance tabl由此可知,由正交设计方案选出的最佳提取方案因素偏差平方和自由度F比Fa临界值显著可行,100g桑黄粗多糖提取率约为216%Factors Sum of square Df F Critical value Sig.42醇沉法精制20.4422取3份41中浓缩提取液,每份10mL分别加入B0.119420.119420695%的乙醇,使乙醇浓度达到70%,冰箱内静置24h,C0.1949019493.3500581过滤再用95%的乙醇沉淀,使醇浓度达90%,过滤程序如图6所示。由表3方差分析结果可知,各因素对试验结果的影响程度是温度>料液比>时间,温度有显著性差异0mL浓缩桑黄水提液32桑黄粗多糖得率的测定70%醇沉24h称取9份约50g桑黄,以最优工艺条件提取提取后于250mL容量瓶定容,摇匀;精确吸取2mL到滤渣(蛋白质、鞣质等杂质,弃去)25mL容量瓶定容,摇匀;按照223方法测定吸光度滤液按下式计算多糖得率%:多糖得率=(CxDW)×100%90%醇沉24h式中:C为样品溶液中多糖的浓度,(g/mL);D为样品溶液的稀释倍数W为称取桑黄的重量,go结果滤液(小分子杂质弃去)滤渣(总多糖)见表4。表4桑黄粗多糖得率表Table 4 Yield of Phellinus linteus ribble Polysaccharide table进行定容测浓度编号桑黄重量g吸光度浓度八mgL)多糖得率/%图6醇沉法精制图tration/(mg/L) Yield/%Fig 6 Ethanol extraction0.2403.0227将滤渣即精制多糖定容至100mL容量瓶内,摇25.02430.247l19匀;吸取5mL定容至25mL,摇匀;按223的方法进3500260.2563.244802252.8144行含中国煤化工55.017803164.0780CNMHG65.03580.24043.1元秉吸附例配直75035803154.06412.528502260.308将壳聚糖用1%的醋酸溶液配成1%的溶液;即8558称取约1g的精制壳聚糖粉末用100mL的去离子水2009年12月食品研究与开发科学研究60第30卷第12期表6醇沉法多糖精制得率表10.80%壳聚糖吸附法的得率为6752%,所以后者精Table 6 Yield of polysaccharides in the method of alcohol制效果较好。al stagnation Extraction编号吸光度浓度mgu)重蠶加ng多糖精刮率%平均值Absorhance Concentration(mg/lYe% Average value%5讨论1l342567101)植物多糖近年来越来越被人们所重视,其广泛12314存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中,是构成生注:W糖糖=6.22g/L·10mL=6122mg命的四大基本物质之一。经过研究由于其具有多种功效,因此对多糖的研究已成为医药食品界的热门领域。溶解,摇匀;再慢慢加入1mL的纯冰乙酸,用力摇匀,2)正交设计是有效的试验设计方法,通过它们的于65℃下恒温水浴放置,待其成为澄清透明的溶液,应用既可以节约大量时间,又可以较好的达到试验目放于冰箱中待用。的越来越多的应用于科学实验43,2壳聚糖吸附剂用量确定3)本试验含量测定方法采用目前国内应用较多取20份浓缩桑黄水提液每份5mL,置于干燥洁的苯酚一硫酸法,机理为:多糖在硫酸作用下先水解成净的试管中,加入壳聚糖吸附剂充分摇匀,置于冰箱单糖并迅速脱水生成糖醛化合物,在490mm左右有中静置24h;然后经两次离心后,上清液倒入20支干较大吸收,具体测定波长可根据扫描结果得到。燥洁净试管中,比较一下经壳聚糖吸附以后溶液的澄4)通过本次试验,优选出最佳桑黄多糖提取精制明度。工艺:通过正交试验得出最佳提取工艺为按114的料最后判定:在每5mL桑黄浓缩水提液中加入水比进行浸泡12h,然后在100℃恒温下,进行30min35滴(约18mL)壳聚糖溶液精制后的溶液澄明度最超声提取;两种精制方法比较,醇沉法的多糖损失较好,即按这种比例进行精制得到的多糖较纯。多,而壳聚糖能够在溶液中形成立体的网状结构,网住4.3.3壳聚糖吸附法精制工艺蛋白质等大分子物质所以壳聚糖法精制效果比较好。取2份桑黄浓缩水提液每份70mL(由于500mL浓缩液用量有限),按比例加入壳聚糖吸附剂490滴参考文献(约25mL),置60℃恒温水浴上加热并以搅拌速度11刘波中国药用真菌M太原山西人民出版社197471-73为100rmin搅拌15min,放置至澄清为止,离心过2)江苏新医学院中药大词典M上海:上海科技出版社1995滤滤液置250mL容量瓶中定容,摇匀;在第一号容1徐双阳桑黄多糖提取分离纯化及理化性质研究浙江工业大学2006量瓶中精密吸取1mL于25m容量瓶(I)中定容,王莉鲁建江刘志勇微波辅助提取红景天根多糖及含量测定的摇匀;继续从一号容量瓶中精密吸取2mL置于25mL研究小中医药学刊,2002,202)227-253容量瓶(Ⅱ)中定容摇匀;接着从二号250mL容量瓶群郑丽伊方积年改良的苯酚一硫酸法测定多糖和寡糖的研中精密吸取1mL置于25mL容量瓶(Ⅲ)中定容,摇究中国药学杂志,1996,31(9550匀;用223的方法测其吸光度值,如表7所示。6]周永治马志庆医药数理统计M]北京:科学出版社20047]段丹丹红景天分散片制备工艺的研究门江苏大学学报200,17表7壳聚糖吸附法多糖精制得率表(5):403-406Table 7 Yield of polysaccharides in the method of chitosan8]吴琼李三鸣姜爱萍等红景天提取液精制工艺的考察印时珍stagnation Extraction国医国药2005,165):395-396编号吸光度浓度(叫)重址a多糖猜制率%平均值%9]贺蕊刘保琴钟红玲等ZTC1+1澄清剂法与水醇法制备荆防口Average value%服液的比较研究中草药1998,2911734-73546612291336798[10] Gi-Young Kim, Hyung-Sik Park, Byong-Hyok Nam. PurificationⅡ281916578and characterization of acidic proteo-heteroglycan from the fruiting47167body of Phellinus linteus(Berk. &M.A. Curtis)Teng J]. Bioresource注:W=70ml×6122(gL)=42854Technology 2003, 89(1): 81-8644精制多糖含量的比较吗由表6和表7的结果可知醇沉法的多糖得率为中国煤化工收稿日期:200302CNMHG