丙烯酸、丙烯醇、乙烯基咪唑三元共聚物的合成

第40卷第4期化工新型材料Vol 40 No 42012年4月NEW CHEMICAL MATERIALS·153丙烯酸、丙烯醇、乙烯基咪唑三元共聚物的合成余磊12韩雅莉1·张卫丽1(1.广东工业大学轻工与化工学院,广州510006;2.广东食品药品职业学院制药系,广州510520)摘要通过沉淀聚合的方法,采用偶二异丁基腈为引发剂,将乙烯基咪哩、丙烯酸、丙烯酶三元共聚,制备了一种具有类似于纤溶酶生物活性的新型高分子。探讨了合成条件对聚合过程、黏度及分子量的影响,并对利用红外光谱(IR)和核磁共搛(NMR)对该共聚物进行了结构表征。纤维蛋白平板实验诬实该共聚物能溶解血栓关键词丙烯酸,丙烯醇,乙烯基咪,三元共聚物Synthesis of a terpolymer from acrylic acid, allyl alcohol and vinyl imidazoleYu Lei.2 Han Yali Zhang Weili(1. Faculty of Light and Chemical, Guangdong University? of Technology, Guangzhou510006:rtment of Pharmacy, Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520)Abstract A new kind of fibrinolytic polymer was synthesized by precipitation polymerization with raw materials ofacrylic acid, allyl alcohol and vinyl imidazole, and with azobisisobutylnitrile as initiator. The effects of synthesis conditionson the polymerization process, viscosity and molecular weight of obtained copolymers were diseussed. The copolymer wascharacterized by infrared spectrum(IR)and nuclear magnetic resonance spectrum(NMR), and its fibrinolytic activity wasdetermined by fibrin plate.Key words acrylic acid, allyl alcohol, vinyl imidazole, terpolymer纤溶酶是生物体内一种能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白用的抗血栓药物提供了理论和实验基础水解酶,它在抑制血栓形成和血栓溶解的过程中起重要作用纤溶酶属于丝氨酸蛋闩酶家族[2,有关研究经证实这类酶的1实验部分活性中心结构高度保守,均由组氨酸(Hi)天冬氨酸(Asp)、1.1试剂与仪器丝氨酸(Ser)3个氨基酸残基组成形成催化三联体36。酶大凝血酶( sigma-T4648);尿激酶,中国药品生物制品检定多是从各种生物组织中分离提取的,其制备工艺复杂且成本所;牛血清蛋白,北京鼎国生物技术有限责任公司。其它试剂高口。利用有机化学方法合成比天然酶简单的非蛋白质分均为国产分析纯。子,模拟酶的催化作用,发展新的非生物催化剂已成为当今酶瑞士 Bruker av400核磁共振仪;美国 Magna7502-Ⅱ型学和药学领域的一个新的研究热点,许多研究者进行了模拟红外光谱仪;德国 OSMOMAT90膜渗透压仪;国产NDJ-1A酶的研究,并且取得了许多有意义的结果, Overberger曾用型旋转黏度计乙烯基苯酚与乙烯基咪唑进行共聚,生成的聚合物能催化31.2三元共聚物的合成乙酰氧基-N三甲基碘化苯胺水解。也有人研究α羟基吡啶准确称量乙烯基咪唑,用HCl气体酸化至pH值小于7。和吡啶苯酚混合物等物质催化小分子底物水解反应,但这将乙烯基咪嘩、丙烯酸、丙烯醇按摩尔比1:1的比例,放入些物质都不能催化水解纤维蛋白这样的蛋白质大分子带有温度计、回流冷凝管和搅拌器的三口烧瓶中,加入溶剂笔者依据纤溶酶活性中心的催化三联体结构,以乙烯基苯。在溶液中加入自由基引发剂偶氮二异丁基腈。加热至50咪唑丙烯酸、丙烯醇为原料,三元共聚合成了一种新型高分100℃,随着反应的进行,逐渐有高分子物质析出,当沉淀物子,该高分子在国内外尚未报道。利用红外光谱和核磁共振不再增加时,停止反应。倒出有机溶剂,减压蒸干溶剂。将产等测试手段对其进行了表征,经检测该高分子侧链含大量咪物溶于乙醇,再将乙醚加入共聚物的乙醇溶液中,得沉淀。离唑基狻基和羟基,与纤溶酶活性中心Hi、Ser、Asp侧链相心,去上清,挥去乙醚,得纯化的乙烯基咪唑、丙烯酸、丙烯醇同,并通过纤维蛋白平板检测,证明该高分子具有纤溶活性三元共聚物。中国煤化工此新高分子的合成与表征为获得低成本、高效、无毒副作CNMHG基金项目:国家自然科学基金项目(30772739),广东工业大学轻工化工学院211工程培育项目(20091015)作者简介:余磊(1980-),男,博士研究生,讲师主要从事应用化学专业的教学和科研联系人:韩雅莉(1957-),女,博导,教授研究方向为生化药物基础·154·化工新型材料第40卷1.3纤溶活性检测1单体浓度对共聚物分子量和产率的影响,结果如图2和图3将牛血纤维蛋白原、牛凝血酶用0.01mol/L的磷酸缓所示。由图2可以看到,当单体浓度增加时,共聚物特性黏度冲液(pH7.2)溶解,先配制0.8%的琼脂糖10mL,煮沸,冷却增大,分子量增加。特别是单体浓度超过40%分子量随单体至45~5℃,加入10mg/mL的牛血纤维蛋白原100μL及浓度增加更明显。这与一般自由基聚合反应的规律相符。因100U/mL的凝血酶250L,迅速摇匀,倒入直径9cm的培养为单体浓度增加单体同长链自由基的有效碰撞几率增大链皿中,盖上玻璃盖冷却凝固后转移到4℃冰箱保存30min备增长速度加快,从而分子量升高。由图3可以看到,单体浓度用。用0.2mL枪头在制备好的纤维蛋白凝胶板上打孔,在各对产率也有类似的影响。单体浓度小于40%时,聚合速率低个孔中加入纤溶高分子化合物水溶液,然后置于37℃培养箱反应缓慢且不完全,产率低,特别是单体浓度小于30%时,反保温24h后观察结果。若有纤溶活性,则会在样品孔周围出应产物不能从乙醚中析出。但单体浓度过大,则会使反应过现清晰透明的纤维蛋白溶解圈,用考马斯亮蓝R250染色后,于剧烈,大量高分子产物快速析出,产物粘结,无法搅拌,如果观察溶圈面积以尿激酶为阳性对照,以蒸馏水为阴性对照单体浓度超过60%会出现爆聚现象。因此单体浓度取50%溶圈面积与纤溶活性成正较合适。1.4纤溶高分子的表征采用KBr固体压片法测定红外光谱,扫描范围000600cm3;以核磁共振仪测定其结构。采用NDJ-1A型旋转黏度计,测该共聚物25℃时10%水溶液的黏度;膜渗透压仪测量不同浓度下的渗透压,对于稀溶液渗透压公式为II RT(1)2333444488题其中,∏为渗透压,C为质量体积浓度,数均M为分子量,生沫(%)R为状态方程常数,T为温度,A为常数。C对作图得直图2单体浓度对黏度(分子量)的影响线,外推至C=0,可求数均分子量132结果与讨论2.1引发剂对共聚物分子量的影响图1为引发剂用量与共聚物分子量的关系,其中,单体浓度为50%反应温度为80℃。可见,聚合物分子量随引发剂用量增加而减少,特别是当引发剂用量小于0.8%(对单体重)时,聚合物分子量增加明显。这与自由基聚合反应引发剂用量与聚合物分子量的关系相符1。引发剂的用量越大,产生34自由基就越多,长链自由基间相互有效碰撞和反应的概率增图3单体浓度对产率的影响加,有利于链终止反应,故分子量小因此引发剂量大些对合2.3反应温度的影响成低分子量聚合物有利。但不能过大,否则反应速率过快反引发剂用量为1%(对单体重),单体浓度为50%时,考察应难于控制,同时还容易使反应体系温度过高而引起羧基的反应温度对共聚物分子量和产率的影响,结果如表1所示。脱水交联和醇酸脱水交联,导致共聚物不溶。而引发剂用量由表1可见在50℃下不发生聚合反应,推测在此温度下偶氮过少,则容易造成聚合物分子量过高同时会造成单体反应不二异丁基腈还未裂解产生自由基。在60~70℃下反应后提纯完全,转化率低下。产物时,发现从乙醇里析出量较少,显然,产率较低,可能产物大部分以低聚物的形式存在,不能从体系中析出。当温度达到80℃时,产率达到最大进一步提高温度,产量未有所增加,因而,确定80℃为合适的反应温度。从表1还可看出,反应温度对产物的分子量影响不大,这可能是因为采取的聚合方式为沉淀聚合这种聚合是当分子量增加到一定值时,产物从体系中析出。所得到的产物分子量较为稳定。2.4共聚物纤溶活性研究861;;;;如共聚物纤中国煤化工a为质量浓度为氮二鼻丁基质)20%共聚物产图1引发剂用量与聚合物分子量的关系CNMHG18%共聚物产生的纤溶圈;c为质量浓度为16%共聚物产生的纤溶圈;d为质2.2单体浓度的影响量浓度为14%共聚物产生的纤溶圈;e为质量浓度为12%共引发剂用量为1%(对单体重)反应温度为80℃时考察聚物产生的纤溶圈;f为质量浓度为10%共聚物产生的纤溶第4期余磊等:丙烯酸、丙烯醇、乙烯基咪唑三元共聚物的合成155·圈;g为质量浓度为8%共聚物产生的纤溶圈;h为蒸馏水阴性对照,为尿激酶阳性对照。3结论表1反应温度对产率和分子量的影响设计了一种具有纤溶酶生物活性的新型高分子,并成功反应温度/℃分子量产率/%将其合成,找到了最佳反应条件。此高分子为乙烯基咪唑、丙烯酸、丙烯醇的三元共聚物,在国内外尚未见此类研究。本研4.6×10420.8究合成的共聚物,在反应过程中受热,仍有纤溶活性,比酶的4,7×104.8×104稳定性强。高分子药物与小分子有机物相比,不容易穿透细4.6×1068.7胞膜,在体内没有受体,故而毒性低。而且与酶相比,成本低廉,有明确的药理作用。该共聚物预期通过进一步的深入研究将会在医药领域有广阔的应用前景。参考文献[1] Kamal, M. Hoog, ]. Kaiser, et al. The purification and characterization of fibrinolytic enzyme frome beauveria bassiana [ J]FEBS Letters,1995,374:363-366[2] Binnie, C, Liao, et al. Isolation and characterization of a geneencoding a chymotrypsin-like serine protease from Streptomyces lividans 66 [J]. Canadian Journal of Microbiology, 1996,42图4共橐物纤溶平板实验284-288.由图4可知,不同浓度的共聚物均有纤溶性,且浓度越[ 3] Rajesh Singh, Chang Jui-yoa, Thrombin A-chain: Activation高,纤溶性越大。remnant or allosteric effector [J]. Biochimica et Biophysica Ac-2.5产物的表征ta,2003,1651:85-92由产物的红外光谱图(图5)可知,2926cm处有1个明显41D.E.Cear, Dang Q.D.,Ayl.Y.M. Molecular mechanisms的吸收峰,为羧基OH伸缩振动吸收;3200cm1为羟基O-Hof thrombin function [J]Cell Mol Life Sci.1997.53(9):710-伸缩振动吸收;1702cm1为羧基上C=O伸缩振动吸收;1448[5 Wolfram Bode. Structure and interaction modes of thrombi1571cm处的多个峰,为咪唑基上C=C伸缩振动吸收;[J]. Blood Cells, Molecules, and Diseases, 2006,36: 122-130.1041~1162cm处的2个峰为羧基和羟基上CO弯曲振动吸[6] Blow DM, Birktoft JJ, Hartley BS. Role of a buried acid group收,796cm处为咪唑基上CH面外弯曲振动吸收峰in the mechanism of action of chymotrypsin [J].Nature,1969由图6核磁共振碳谱可知,17.22为亚甲基碳化学位移25:221(5178):337-340.57.65为主链上连氮碳的化学位移,66.98为羟基碳的化学位7]李建武,生物化学实验原理和方法[M].北京:北京大学出版移,110~134处为咪唑基上碳的化学位移。194.54处为羧基社,1994,216223.上羰基碳的化学位移。波谱解析可知,该高分子产物含有咪[83 Overberger C. G, Kwon Byongdo. Esterolytic reactions of ac唑基、氨基、羧基,为目的产物。tive esters using heterogeneous polymeric catalysts containingimidazole groups [J. American Chemical Society, 1983:93[9] Swain C. G., Brown J F, Concerted displacement reactionsVIIL. polyfunctional catalysis [J]. American Chemical Socie-ty,1952,74:2534-2538.[10] Harry Ladenheim. Herbert Morawets. Reactions of polymerwith reagents carrying two interacting groups. II. Bromine dis-placement from a bromoacetamide and the bromoacetate ion by图5共聚物的红外光谱图poly-(methacrylic acid)and poly( vinylpyridine betaine)[J].American Chemical Society, 1959. 81: 4860-4863[11] Astrup, T., Mullertz, S. The possible role of oral epithelialcells in tissue-type plasminogen activator-related fibrinolysishuman saliva [J]. Archs Biochem Biophys, 1952,40:346-351[12] Cryns V, Tuan J. Proteases to die for [J]. Genes &.Devw H[13] Flory中国煤化工 e polymer solutions14]林尚CNMHG北京:科学出版社220200180160140120100906002001982,336,420-424,483-484图6共聚物的CNMR谱图收稿日期:2011-07-30