用聚乙二醇分离富集microRNA的方法探讨

医学分子生物学杂志,2009,6(6):518-520 Med Mol Biol,2009,6(6):518-520doI:10.38700/ issn1678009.2009.06.010用聚乙二醇分离富集 microRNA的方法探讨骆明勇,钟华敏广州市妇女儿童医疗中心儿童医院检验科广州市,510120【摘要】目的探讨用聚乙二醇( polyethylene glycol PEG)溶液分离富集miRNA的操作方法和分离富集效果,并与 Ambion公司的 miRNA分离试剂盒分离效果进行比较。方法用PEG溶液和 Ambion公司的 miRNA分离试剂盒从肝脏组织总RA中分离富集 miRNA,用变性琼脂糖和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分离效果,并在富集的 miRNA中用RT-PCR扩增miR-122鉴定是否有效地回收了 miRNA结果PEG和 Ambion公司 miRNA分离试剂盒都能有效地富集mRNA,PEG富集的RNA片段比 Ambion公司的试剂盒的大。结论PEG溶液能有效 miRNA地分离富集,和 Ambion公司的 miRNA分离试剂盒分离效果相当,并具有操作简便、快捷及成本低廉的优点。【关键词】 microRNA;聚乙二醇;mi-122【中图分类号】Q522 Isolation and Enrichment of MicroRNA by use of Polyethylene Glycol LUO Mingyong, ZHONG Huamin Laboratory Department of Children's Hospital, Guangzhou Medical Center for Women and Children, Guangzhou, 510120, China [Abstract] Objective To develop approaches for isolating and enriching microRNA with Poly- ethylene Glycol (PEG), in comparison with the microRNA isolation kit produced by Ambion com- pany. Methods microRNA isolation and enrichment were performed in liver tissue with PEG and Ambion microRNA isolation kit. The products produced with two methods were evaluated by electro- phoresis on denaturing agarose gel and denat lyacrylamide gel. miR-122 was detected by RT- ent fraction to verify the recovery of microRNA in isolation process. Results Peg method was able to successfully enrich microRNA, similarly to Ambion microRNA isolation kit. The RNA fragment enriched by PEG was larger than that obtained b Ambio croRNA isola- tion kit. Conclusion PEG can enrich microRNA as efficiently as Ambion microRNA isolation kit. with advantage of easy and quick manipulation and low cost.【 Key words】 microRNA polyethylene glycol;mir-122 microRNA(miRNA)是一组生物体基因组编茎环结构的逆转录引物的T-PCR方法也被发展了码的内源的非编码小RNA(RNnoncodimgsmalL《,RN起来,大大地提高了miRNA检测的灵敏度但A),广泛分布在动植物及病毒等生物体中。研由于 miRNA在细胞或组织中含量非常低,从总究表明, miRNA与动植物的发育、细胞生长分化RNA中富集mRNA是 miRNA实验中一个重要的步和凋亡、脂肪代谢以及人类重大疾病密切相关,近骤。目前,一些生物技术公司已开发出了一些用于年来成为了生命科学的研究热点14。分离富集 miRNA的商品试剂盒,分离效果好且使随着生命科学研究的发展, miRNA研究方法用方便,但是价格昂贵。在本研究中,我们拟对采层出不穷并不断地得到改进。研究方法有克隆表用聚乙二醇( polyethylene glycol,PEG)分离富集达、 Northern印迹及生物芯片等;一种新的采用带 miRNA的方法进行探讨。1材料和方法通讯作者:骆明勇(电话:020-81330633,-mail:luo-my@163. com) Correaponding author: LUO Mingyong(tel:86-0813063,1.1试剂和仪器 mail: luo-my@ 163. com)PEG6000和氯化钠购自加拿大BBI公司;人肝医学分子生物学杂志,2009,6(6):518-520 Med Mol Biol,20096(6):518-520519脏组织总RNA和 miRNA分离试剂盒(mirVana miR表1mir-122和u6rna的rt-pcr引物 NA isolation kit)购自美国 Ambion公司;糖原购自引物序列(5→3)美国 Invitrogen公司低分子量 DNA marker购自美i-122RT引物 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGC-国NEB公司;垂直电泳槽和电泳仪购自美国Bio- TATTCGCACTGGATACGACACAAACrad公司;PCR仪购自美国 MJ Research公司;低温pcr引物 GCCGTGGAGTGTGACAATGGT正向:台式离心机购自德国 Eppendorf公司;寡核苷酸在英反向:GTGCAGGGTCCGAGGTu6pcr引物正向:CTCGCTTCGGCAGCACA骏( Invitrogen)公司合成。反向:AACGCTTCACGAATTTGCGT1.2实验方法1.2.1Pg6000溶液的配制分别称取PEG2结果600013.0g,氯化钠9.36g溶于100 ml DEPC处理液中。PEG的终浓度为13%(mv),氯化钠的终2.1miA高集后的电鉴定浓度为1.6molL。溶解完后用0.2μm滤器过滤,肝脏组织总RNA和富集后的 LMW RNA、4℃保存备用。 HMW RNA的甲醛变性琼脂糖电泳和变性聚丙烯酰1.2.2肝脏组织 miRNA的富集过程PEG600胺凝胶电泳结果见图1和图2溶液富集 miRNA的方法简要过程为:在肝脏组织A123B123总RNA(1μg/)100溶液中加入等体积的PEG6000溶液,室温放置10min;然后在4℃,28s12000c/min离心15min。总RNA被分为两部分,18s28s上清液即为低分子质量RNA( low molecular weight18sRNA, LMW RNA),沉淀为高分子质量RNA(high molecular weight RNA, HMW RNA);在上清中加5.8s5.8s入0.1倍体积醋酸钠(3moL,pH5.2)和糖原 5s 5s(终浓度为1ng/),再加入2.5倍体积无水乙醇,-20℃放置1h沉淀 LMW RNA, miRNA就富集在图1甲醛变性琼脂糖(1.2%,各条带RNA上样量都为0.5μg)RNA电图 LMW RNA中。A:PEG分离电图;B: Ambion公司 miRNA分离试剂 AmbionmiRNA公司的分离试剂盒(mirVana盒分离电泳图 miRNA isolation kit)分离富集 miRNA按照试剂盒1:总rna;2: HMW RNA3: LMW RNA说明书进行。1.2.3 miRNA分离富集结果的鉴定分离后的12345 LMW RNA和 HMW RNA各0.5μg用1.2%甲醛变性琼脂糖RNA电泳和15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定其分离效果。为了验证两种方法是否有效地富集回收了5.8s miRNA,我们在富集的样品中进行 miRNA的RT 5sPCR实验。由于我们富集用的总RNA是肝脏组织 IRNA总RNA,就选取在肝脏组织特异表达的miR-122图2变性聚丙烯酰胺凝胶(15%)电泳图进行t-r,并同时扩增U6NA1:总RNA;2:PEG分 HMW离 RNA;3:PEG分离miR-122的Rt-Pcr简要过程为:对mir- LMW RNA Ambion试剂盒分离 HMW RNA5:122设计一条带茎环结构的逆转录引物以及相应的 Ambion试剂盒分离 LMW RNA一对PCR引物(序列见表1);10μ逆转录体系中M-MLV逆转录酶100单位、50 nmol茎环结构从甲醛变性琼脂糖电泳图上可以看出用PEG的引物和U6RNA逆转录引物、 LMW RNA10ng;沉淀和 Ambion公司的 miRNA分离试剂盒都能将高逆转录后进行PCR,PCR条件为95℃15s,60℃分子质量RA(如28 rRNA和18r)有效308,进行20个循环。同时在另一管中扩增U6地去除,只可见5rA和5.8srNA的条带,RNA,U6RNA的PCR引物见表1。低分子质量RNA得到了很好的富集。同时变性520骆明勇,等.用聚乙二醇分离富集 microRNA的方法探讨PAGE电泳图上都可以清楚地看见,两个方法富集的、具有显著优越性的方法,在一般的RNA实验都可以清楚地看见 LMW RNA的tRNA、5 rRNA室即可进行操作。和5.8 rRNA的条带,并且在 HMW RNA中较少 miRNA由于在细胞和组织中含量低,所以不看到5.8srna以下的RA;EG富集的LMW管是 miRNA克隆、 Northern印迹还是生物芯片检RNA条带的加样孔 Ambion中的亮度比公司的miR测都需要对总RNA进行分离富集。分离方法也层NA分离试剂盒分离的亮,并且PEG富集后HMW出不穷,最开始研究人员采用PACE电泳分离,RNA条带中的剩余的5.8S条带较暗,而 Ambion miRNA,此方法难度大、复杂且操作繁琐;公司的 miRNA分离试剂盒分离后的 HMW RNA条等率先采用PEG的方法分离富集miR带中可以较多地看到5.8SRNA部分,说明 PEG NA,取得了满意的结果。该方法具有操作简便、方法富集的低分子质量RNA部分包括有较多的成本低廉等优点,且不影响 miRNA的后续反应,5.8s部分综上所述,两种方法都能有效地富集的 miRNA可以进行各种酶学反应。近年来,富集低分子质量RNA(包括 mRNA部分),PEG生物技术公司开发出了各种 miRNA分离试剂盒,富集的RNA片段比 Ambion公司的试剂盒的大这些试剂盒方便使用,为研究工作者提供了方便,2.2miR-122的RT-PCR检测但是试剂盒都比较昂贵。本研究用PEG的分离方PCR产物的电泳图见图3。miR-122的PCR产法和 Ambion公司的 mRNA分离试剂盒进行了比物长度为59bp,u6的PCR产物长度为94bp。从较,两种方法都能有效地分离富集 miRNA,但RT-PCR结果可以看出,两种方法富集的低分子质PEG的方法具有成本低廉操作便捷,为研究工量RNA中都能很好地扩增出miR-122和U6RNA。作者提供了另一个较好的方法选择。说明两种方法都能有效地富集回收 miRNA。在用乙醇沉淀回收低分子质量RNA时,加入糖元是必需的。糖元作为核酸沉淀的载体可以使 bp U6 MiR-122 bp miRNA不易丢失且操作更方便,糖元也可以用如766 Takara公司的核酸共沉淀剂等替代。 Ambion公司500的 miRNA分离试剂盒也是一个使用较方便的试剂350盒,但是价格较昂贵,另外我们在使用 Ambion公300250司的 miRNA分离试剂盒的过程中也发现,由于试200剂盒的洗涤缓冲液在低温下容易析出盐结晶,如果15010094使用前溶解不充分就会将盐分残留在富集的miR7559NA中,从而影响后面的酶学反应。5025参考文献 [1] BARTEL D P. MicroRNAs: genomics, biog图3肝脏组织miR-122和U6 RNA RT--PCR电泳图 function[j.cell,204,116(2):281-29 [2] YANG M, L Y, PADGETT R W. MicroRNAs: Small regulators with a big impact]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005, 16(4-3讨论5):387-393. [3] WIENHOLDS E, PLASTERK R H. MicroRNA fu miRNA是近年来生命科学的研究热点,研究4] MISKA的方法也发展得较多,但由于 miRNA在细胞和组 and death[].织中含量很低,所以 miRNA大部分的的研究方法 [5] CHEN C, RIDZON D A, BR cation of microRNAs by都需要预先对其进行分离富集。本研究对PEG分Res,20053(20):e79[6]骆明勇,杨戎,张亮,等M对肝癌细胞基因表达离富集 miRNA的方法进行了探讨,成功地摸索出谱的影响[]中国生物化学与分子生物学报,007,23(8):644651了用PEG6000溶液离心沉淀分离 miRNA的方法。[7 BASKERVILLE. BARTE鉴定结果显示PEG溶液能有效地分离富集 miRNA, NAs reveals frequent co with neighboring miRNAs and host genesjrna200511(3):241-247并和 Ambion公司的 miRNA分离试剂盒分离效果相 THOMSON PARKER PEROU et al cust当,PEG分离富集的RNA片段略大于 Ambion公司 platform for analysis of mieroRNA gene expression[ J]. Nat Methods,20041(1):47-53的 miRNA分离试剂盒。但PEG分离富集的方法具(200908-17收稿有操作简便、快捷及成本低廉的优点,是一种实用