生物法制备乙醇酸的研究

研究报告中国酿造2011年第3期总第228期·35·生物法制备乙醇酸的研究尹秀莲!,游庆红2,蒋中海(1淮阴工学胱生命科学与化学工程学院,江苏淮安223001;2南京工业大学食品与轻工学院,江苏南京210009摘要:目的:对氧化葡萄糖酸杆菌生物转化乙二醇生产乙醇酸的工艺进行研究,方法:首先采用单因素试验优化了氧化葡萄糖酸杆菌生物转化乙二醇生成乙醇酸的工艺在此基础上通过正交试验对转化工艺进行了进一步探讨。结果:氧化葡萄糖酸杆菌生物转化乙二醇生成乙醇酸的最优工艺为126%静息细胞56%乙二醇维持pH5.84转化48h,乙二醇单体转化率可达60.886%,结论应用氧化葡萄糖酸杆菌生物转化乙二醇生产乙醇酸的工艺的切实可行关键词:氧化葡萄糖酸杆菌:乙二醇:乙醇酸:单因素试验中图分类号:TQ9206文献标识码:A文章编号:0254-50712011)03003503Preparation of glycolic acid by biotransformationYIN Xiulian YOU Qinghong", JIANG Zhonghai( College of Life Sciences and Chemical Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huai'an 223001, China; 2. College of Food Scienceand Light industry, Nan ing University of Technology, Nanjing 210009, China)Abstract: Objective: Study on transformation technology of ethylene glycol to glycolic acid by Gluconobater oxydans. Methods: Biotransformationfrom ethylene glycol to glycolic acid by G. oxydans was optimized with single factor experiments and further study with orthogonal experiment, Re-sults: the optimum conditions for ethylene glycol transformation were as follows concentration of resting cells 12.6%, ethylene glycol 5.6%, PH 5.8448h. Transformation rate reached 60886%under the optimum conditions. Conclusion: biotransformation of ethylene glycol to glycolic acidoxydans is practicableKey words: Gluconobacter oxydans, ethylene glycol; glycolic acid; single factor experiments乙醇酸又称羟基乙酸、甘醇酸在自然界尤其是甘蔗、而应用生物法合成乙醇酸,不但产品质量高,而且反应条甜菜以及未成熟葡萄汁中存在,可用于制备生物医用材料件温和,产物易于分离。试验对利用氧化葡萄糖酸杆菌转和生物可降解新材料等诸多领域,但其含量较低,且与其化乙二醇生产乙醇酸的工艺进行了初步研究,为乙醇酸的他物质共存,难于提纯分离。目前乙醇酸的生产方法主要生产开拓一条新的可能途径有氯乙酸水解法、羟基乙氰水解法、乙二醛氧化法、草酸电1材料与方法还原法等化学方法但此类方法大多存在需要使用有毒有1.1材料害原料,产物分离纯化困难难以得到纯品等缺点。近年1.1.1菌种及主要试剂来,医药和化妆品行业对高纯度乙醇酸的需求越来越大,氧化葡萄糖酸杆菌( Gluconobater oxydans,GOX,本收稿日期:2010-1207基金项目:江苏省科技计划(BE203084):淮阴工学院青年科学基金项目(HGC0918)作者简介:尹秀莲(1978),女,讲师研究方向为生物催化及天然活性成分提取分离萄糖含量不是很高的情况下,麦麸和玉米粉2种天然的营床转速),可使得菌丝产量提高。由于木霉真菌T68对环境养物质能够为木霉的生长提供全面的营养因子。一方面,的广适性和低要求,使木霉在我国的生防菌剂中占有重要在培养基中少加些葡萄糖,可以大大降低生产用成本;另地位该试验可为今后研制开发木霉菌剂提供理论依据。方面,玉米粉和麸皮是一类来源广泛易得的原料,而通过试验可知,玉米粉的含量对木霉菌丝体干重的影响最为参考文献显著,含量过低将不能满足木霉生长的要求:同时,麦麸刘梅,徐同木的背养生长及发酵条件团云南农业大学学报,除含有丰富的有机氮外,还含有多种营养因子和无机元素2]吴克刘斌等.木幂T6木聚糖酶液态发醇生产研究食品与(如生物素、磷等),可促进菌体的生长。二者作为培养基发酵工业,200027):9-12.对木霉进行工业化发酵投入成本将可大大较低]王中国煤化工单培养基优化组合正交筛选迄今为止,对木霉真菌防治各类植物病害的研究多集中在木霉生防机制方面对木霉真菌的发酵条件研究较少。林CNMHG百草粘杆产纤维素酶的研究湖南农业科学,2007(3):4648该试验结果表明,木霉真菌T68生长要求的温度和pH值范(吴克蔡礅民等木霉株T6木聚糖酶固态发酵条件和酶学性质围较广,且选择适宜的营养因素和发酵条件(如温度、摇研究[门物系统2001(20):191-1952011No336· Serial No228China BrewingResearch Report实验室保存;乙二醇(分析纯)。因为随着细胞浓度增大,相应地催化转化反应的酶量也增1.1.2培养基闪加了,从而加快了酶转化反应的速率;此后随着细胞浓度斜面培养基:6%山梨醇,3%酵母粉,03%KHPO,0.1%进一步增大,转化率有所降低,这可能是由于较高的细胞MgSO7HO,0.1%味精,2%琼脂。浓度造成细胞的破裂以及内含物释放,污染反应系统,降种子培养、基础发酵培养基:6%山梨醇,3%酵母粉,低转化率;因此静息细胞浓度选择120g/L,即12%(wv)细03%KHPO,0.1%MgSO47HO,0.1%味精,pH60胞浓度。1.1.3主要仪器HP1100系列高效液相色谱仪,HP6890 Series气相色谱仪,离心机(M304781),手提医用蒸气压力灭菌锅(DSX280B),摇床(KYC-111),超净工作台(SwCJ-2F)。警12方法斜面培养:将保藏斜面菌种转接斜面培养基,28℃培养3d种子培养:将斜面荫种转接到含15mL发酵培养基的150mL摇瓶中,28℃、200r/min振荡培养24h田1不同静息细胞浓度对转化率的影响基础发酵培养:按10%的接种量接入含150mL发酵培Fgue1. Effect of resting cell concentrations on molar conversion养基的500mL摇瓶,28℃、200rmin振荡培养。静息细胞的制备:发酵液8000min离心10min,弃上21.2不同底物浓度对转化率的影响清液,收集菌泥用无菌蒸馏水洗涤2遍,得静息细胞。底物浓度刈转化反应有一定影响,以21的优化为基底物转化培养配好底物转化液,灭菌接入适量静息础考察了不同乙二醇底物浓度对反应的影响结果见图2。细胞,28℃C、220r/min摇床培养48h分析方法:采用HPLC分析乙醇酸方法。样品预处理:取1mL~2mL转化液,8000min离心l0min,045μm滤膜过滤超纯水稀释一定倍数制成待测液色谱条件:色谱柱: Agilent ZoRBSX SB-Aq5μm,46mmx25omm);流动相:0.1%的磷酸溶液(pH25);检测波长:210nm:流速:04mmin;进样量:10L:柱温:30℃气相色谱(GC)分析乙二醇方法:乙二醇检测方法采用GC,具体方法见文献[4]。田2不同底物浓度对转化率的影响转化条件的优化:将适量静息细胞悬浮于一定pH值 Figure2 Effect of substrate concentrations of on molar conversion的0lmoⅥ磷酸盐缓冲液中,加入适量底物乙二醇,250mL摇瓶装液30mL振荡培养48h,中间取样1mL,离心,测定上由图2可知,当乙二醇浓度低于6%时,反应转化率为清液中乙二醇及乙醇酸的量6%左右,随着底物浓度的增加,转化率明显下降,在底物乙二醇转化率的计算:浓度为100g/L时转化率仅为37%,这说明过高浓度的底乙二醇转化率=转化后反醇酸摩物会对反应产生强烈的抑制作用,不利于转化反应的进行,二醇摩x100%高浓度的底物不适合转化反应,综合考虑,研究选择6%底2结果与分析物浓度2l氧化葡萄糖酸杆菌转化乙二醇生成乙酵酸的单因素213不同pH值对转化率的影响研究由于GOX转化反应过程中不断生成酸,导致其转化过211不同静息细胞浓度对产物转化率的影响程中pH值会逐步降低,导致偏离起始pH值以2.1.2优化结许多因素会影响产物转化率,其中采用全细胞转化时果为基梁用掉制不同mH值的方法考察了其对转化静息细胞的浓度对反应有较大影响在底物浓度为6%转率的划中国煤化工化过程中控制pH值为60时,分别考察不同静息细胞浓度对CNMHG率影响较大,当pH产物转化率的影响结果见图1。值<60时转化率随pH值增大而快速增加:当pH>60时,由图1可知,起初转化率随着静息细胞浓度增大而迅转化率随pH值增大而逐步降低:若控制pH值为60,转化速增加,静息细胞浓度为120g时转化率可达60%:这是率可达65%,这可能是因为pH值影响了转化反应相关酶系2011年第3期研究报告中国酿造总第228期37·的性质,从而导致转化率的变化。失拟项反映的是试验数据与模型不相符的情况,p0.293,表明失拟不显著,因此模型选择正确;同时由冋归分析得出R=9935%,也充分说明了回归方程的可靠性:因此,可以利用该冋归方程确定最佳提取工艺条件。表3晌应面回归分析结果Table 3. Results of AnOvA来源自由度平方和校正平方和校止均方F96L20176120176.800219.15000055055606570线性31.05251.05250.35086150023平方354.8942548942182981320.62000图3不同叶值对转化率的影响交互作用352550525501.751730690000gure 3. Effect of pH value on molar conversion失拟3734残差误差70.399503995005713022750.22750.07581.76029322GOX转化过程的响应面优化纯误差0.17200.172000430在21单因素试验的基础上,选择直接影响转化效果的1661.6012静息细胞浓度、底物浓度、转化pH值3个因素进行响应面优化,以反应转化率为指标,确定最佳转化条件,试验因素根据回归分析结果做出相应的响应曲面图,以确认静与水平设计见表1,响应面试验方案及结果见表2息细胞浓度、底物浓度、转化pH值3因素对反应转化率的影响,结果见图4。表1响应面分析试验因素与水平1. Factors and levels of RSM analysis水平X细胞浓度/(g·100mL)x2底物浓度%XpH值61.5126.065表2转化反应响应面分析方案及试验结果一试装Table 2. Experimental design and resutts of RSM转化率%57.712345678905857.1度57.82345676L.6086L255.046095.560.7度根据表2的试验结果,通过 Minitab软件处理确定回归中国煤化工率影响的响应面图方程:Y=6094101625X02875X051995X1845X2ontours of Yaf(X, X M(a)CNMHG207X3005XX0675XX0.925XX对表2进行方差分析,结果见表3从方差分析(表3)中可知,二次项和交互项由各因素对响应值的影响(图4)可知底物浓度(X2)对响应值的影响极显著而一次项对响应值的影响不明显,对反应转化率的影响最为显著,表现为曲线较陡:而静息2011No.338· Senal No228China BrewingResearch Report清香型大曲及酒醅中拟内孢霉的分离鉴定刘志磊2,曹健3,王德良2,王旭亮2,胡建华←(1河南工业大学,河南郑州450001:2中国食品发酵工业研究院北京10007;3中原工学院,河南郑州45000;4北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂,北京10301摘要:从某清香型大曲及酒醅中分离出80株酵母类微生物对其初步分类后通过平板分离培养、显微镜形态观察和分子生物学实验等综合分析,鉴定出其中1株为肋状拟内孢霉。该研究克服了酵母微生物形态相似,生理生化特征相近,传统方法难以鉴定的缺点,拟内胞霉的鉴定提供参考关键词:清香型白酒:微生物:拟内孢霉:分子鉴定中图分类号:Ts2611文献标识码:A文章编号:02545071(2011)030038-03Isolation and identification of Saccharomycopsis fibuligera from Fen-flavor Daqu and fermented grainsLIU Zhilei, CAO Jian", WANG Deliang WANG Xuliang, HU JianhuaHenan University of Technology, Zhengzhou 450001, China; 2. China National Research Institute of Food& FermentationIndustries, Bejing 100027, China; 3. Zhongyuan University of Technology, Zhengzhou 450007, China;Abstract: Eighty yeasts strains were isolated from Fen-flavor daqu and fermented gains in distillery. One strain was finally identified as Saccharomy-copsis fibuligera through comprehensive biology experiments of morphology and molecular. The morphology of yeasts microorganism and theirphysiological and biochemical characteristics are similar, it is difficult to identify yeasts with the traditional method. The morphological characteris-tics and molecular identification of Saccharomycopsis fibuligera were studied in this experiment. It could provide some references for Saccharomycopses fibuligera identificationKey words: Fen-flavor; microorganisms; Saccharomycopsis fibuligera; molecular identification拟内孢霉是大曲中的主要上霉微生物,在酒醅发酵过程中广泛存在。一般认为拟内孢霉主要起糖化作用,可收稿日期:2010-11-24基金项目:国家科技支撑计划(2008BA163B06)作者简介:刘志磊(1985)男河南南乐人,硕士研究生,研究方向为食品微生物:王德良·高级工程师通讯作者细胞浓度(X)与转化pH值X)次之,表现为曲线相对平3结论与展望滑,且随其数值的增加或减少反应转化率变化相对较小。3.1以乙二醇单体转化率为指标,在单因素试验的基础上底物浓度和转化pH值之间的交互作用最为明显;静息细胞应用响应面分析对GOX转化乙二醇生产乙醉酸的转化条浓度和转化pH值交互作用次之;静息细胞浓度与转化pH值件进行了研究结果表明,最佳转化工艺为采用126%静交互作用最不显著其对反应转化率的影响规律并不会随息细胞浓度、56%乙二醇浓度在pH584的条件下转化48h着另一因素的改变而有明显变化乙二醇单体转化率可达60.886%根据所得到的回归模型分别对X、X2、X求偏导数32乙醇酸是一种有重要应用的产品尽管试验开发了其并解方程组,可知当X00463256,X=0.0715739,X产一条新的生产途径但由于成本等因素制约了其在工业0.0277932时反应转化率为60956%;即稳定状态下的最生产上的应用,今后如能通过进一步优化转化工艺,降低优工艺是细胞浓度1255%底物浓度为557%6pH值5833,生产成本,必将会推动我国乙醇酸产业的快速发展在此条件下反应转化率理论上可达60.956%23验证试验参考文献为了验证预测结果是否真实有效根据以上预测进行]田克胜,王保伟乙醇酸的合成及应用天然气化工,20031(6了近似验证试验,考虑到操作方便,将最佳工艺条件修正为:细胞浓度16%、底物浓度为56%叫H值584在此条四王"Ⅵ1中国煤化工及生物转化性能的研究件下进行3次平行试验,结果转化率分别为6086%6089%6091%平均转化率为6088%,与理论预测值相比相对]卢LCNMH相色谱测定在乙醇酸和草酸存在下的乙醛酸含量门理化检验化学分册,2006,42(8):644646误差仅为0.11%,较好地证明了此模型能模拟和预测试4陈亚飞,孙宇宋玉娴,等气相色谱法测定羟乙基淀粉中乙二醇的验结果。残留量中国药事2007,21(5):327-329