添加剂对白芨组培的影响

云南农业大学学报Joumal of Yunnan Agricultural University, 2011, 26 (6): 821 -827http: //xb. ynau. edu. cnISSN 1004 - 390X; CODEN YNDXAXE-mail: xb@ ynau. edu. cnDOI: 10. 3969/j isn. 1004 -390X (n) . 2011. 06. 016添加剂对白芨组培的影响赵漫丽'，黄春球”，李明静”，邓文祥’，李枝林'""(1.云南农业大学园林园艺学院，云南昆明650201; 2.云南植物药业公司，云南昆明650111;3.云南农业大学资源与环境学院，云南昆明650201)摘要:用植物组织培养方法研究了添加剂对白芨组培的影响。结果表明:最适合白芨种子萌发的配方是: MS+1.0~3.0mg/L BA +1.0 mg/L NAA +3 g/L碳粉.最高萌发率可达99.7%;最适合白芨继代增殖的配方为:MS+1.0~2.0mg/L BA +2.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+4.0g/L琼脂+15g/L魔芋粉，添加魔芋粉利于提高增殖率;而配方1/2 MS+0.5 mg/L BA+1.5 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA +70g/L香蕉泥，最利于生根，且根系较健壮，利于提高炼苗成活率。关键词:白芨;组培;添加剂中图分类号: s 682. 31. 043文献标识码:A文章编号: 1004 -390X (2011) 06 -0821 -07Additives on the Tissue Culture Technology for BletillaZHAO Man-li'，HUANG Chun-qiu3，LI Ming-jing", DENG Wen-xiang' , LI Zhi-lin'(1. Institute of Flowers, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;2. Phytopharmaceutical Company Limited.，Kunming 650111, China;3. College of Resources and Environmental Science, Yunnan Agriculural University，Kunming 650201, China)Abstract: additives on the tissue culture technology for Bletilla striata were studied. Results showedthat: the most suitable sterile seed germination Betilla tssue formula was: MS+ 1.0~3. 0mg/L BA .+1. 0 mg/L NAA +3.0 g/L carbon, resulting in the highest germination rate of99. 7%. MS +1.0 ~2.0 mg/LBA + 2.0 mg/LKT + 0.5 mg/LNAA + 4.0g/L Agar + 15 g/L konjac flour was the bestproliferation medium, and the konjac powder is more conducive to increases the proliferation rate; and1/2 MS + 0.5mg/L BA + 1.5mg/LNAA + 1.5 mg/L IBA +70 g/ banana mush was favorable forrootage and the vigorous growth of the induced shoots, helping improve the survival rate of hardening.Key words: Bleilla; tissue culture ; additive白芨[ Beila striata (Thunb. ) Reichb. f. ]为重点保护的野生药用植物之一_(5)。为兰科( Orchidaceae)白芨属多年生草本植目前，关于白芨组培快繁的研究报道较.物",是我国民间传统珍贵中药材之-2)，市场多[2-6)，但在白芨组培过程中加入不同添加剂对需求量很大，在自然状态下，繁殖困难[)。近年快繁技术研究未见报道。本文研究添加剂对白芨来，人为过度采挖和天然生境遭到破坏使野生白组培的影响，研究结果对白芨的快繁、工厂化生芨资源急剧减少，濒临灭绝[4]。白芨已被中国列产、开发利用等有重要的参考价值。收稿日期: 2011-04-13修回日期: 2011 -06-02网络出版时间: 2011-11-14 17:36*基金项目:云南省重点产品创新工程资助项目(208IF007)。作者简介:赵漫丽(1984 -),女，云南大理市人，白族,在读硕士研究生,主要从事国兰组织培养研究。E-mail!: 1441800595@ qq com. *通讯作者Corresponding author:李枝林(1955-),男，云南大理宾川中国煤化工:卉育种和栽培方面研究。E-mail: lzl-yn@ sohu. comCNMH GH网络出版地址: http: //www. enki. neV/kems/ detail/53.1044. S. 2011114. 1736.201106820_ .016. html822云南农业大学学报第26卷浓度的BA用量(处理5)污染率较高。在本组1材料与方法试验中，利于种子萌发的是(处理4)配方。1.1材料表1不同激素浓度对白芨种子萌发的影响白芨种子采自云南植物药业有限公司,栽植Tab. 1 Efects of dferent hormone concentration在团结乡温室大棚的药用白芨，在5~6月开花时on Beilla germination节，选择健壮的植株进行人工授粉，当年9~10处理培养基NNAA萌发率/%污染率/%月采收略黄饱满的蒴果。culuregemination contaminationtreatment(mg.L-')(mg.L")1.2方法mediumpercentage percentage1.2.1材料处理MS.51.085.63.1用干燥纸把蒴果表面擦净，装于自封袋，放M:.01.88.12.54 C冰箱预处理7 ~9d后，用洗衣粉水洗涤7~1090.21.7min,置流水冲洗6~8 min,把蒴果纵剖，取出种91.9子，用75%酒精消毒30s, 10%次氯酸钠处理1087.52.min,无菌水洗2~3次，再用0.1%的升汞消毒5min,无菌水洗4~5次。另用10%氢氧化钾浸泡.表2是在表1筛选出利于白芨种子萌发适当5~6 min,无菌水洗4~6次”。激素配比的基础上，添加不同碳粉用量来探讨对1.2.2培养白芨种子萌发的影响。碳粉用量范围是2~6 g/L,将种子播于培养基面上，置23 ~25 C的环境梯度用量为1g/L。从表2中可以看出，在本组试暗培养10~15d,移到光照强度2 100 lx下进行光验中萌发率最高的处理2，达99.7%。处理2中.培养10~15d,即有少量种子吸水膨大(如米粒BA的浓度是1.0mg/L，NAA的浓度是大小)，约7d变绿长成圆球茎，逐渐有小苗分1.0 mg/L,由此表明:在添加碳粉试验中，细胞化。将原球茎转人不同添加剂的增殖培养基上进分裂素:生长激素类=1:1时，促进白芨种子萌行继代培养。待丛生芽长到3~4cm高，带有3~发。从处理2~5,萌发率逐渐降低，说明两种激4片叶以上的健壮幼苗时，切下转人不同添加剂素配比超过1:1时，抑制种子萌发。对于污染率,的生根培养基中，诱导生根。白芨增殖和生根阶与表1中的相同，(处理1)和(处理5)的污染段，采用每天光照12 h,光照强度为1500 ~率相对较高。通过比较表1和表2，显示出表220001x,培养温度(24 +2)C;萌发和增殖培养中每一处理的萌发率都比表1中的高，并且污染采用MS基本培养基，生根用1/2MS培养基，蔗率都相应降低。这说明添加碳粉有利于白芨种子糖3.0%，pH 6.0~6.2。最后把生根壮苗的完整萌发，并且降低在萌发过程中的污染率。植株取出，清净，进行炼苗、移栽。2.2不同培养基对 白芨增殖的影响表3是不同激素浓度对白芨增殖的影响，是不2结果与分析同培养基对白芨增殖影响的对照试验。在2.1不同培养基对 白芨种子萌发的影响0.5 mg/L NAA水平上，设计了5个处理，BA和表1是不同激素浓度配比对种子萌发的影响。KT的浓度用量相等,并且浓度梯度是0.5 mg/L,以MS为基本培养基，在1.0 mg/L NAA的水平筛选利于白芨增殖的激素配比。从表3中可以看上，设计了5个BA的浓度梯度,浓度梯度为0.5出，增殖率从处理1 ~4依次增加，到处理5就下mg/L。从表1中可以看出，萌发率萌发率最高的降，表明:激素配比高不利于白芨增殖培养。增殖是第4个处理: BA含量为2.0 mg/L, NAA含量率最高的是处理4, BA和KT浓度用量是为1.0 mg/L,萌发率达91. 9%。白芨种子萌发率2.0 mg/L, NAA的浓度用量是1.0 mg/L,细胞分随着BA浓度用量的增殖而呈上升趋势，当BA的裂素:生长激素类=4:i1,并且琼脂用量是7.5g/L,浓度用量超过2.0mg/L,萌发率就比处理4下降此时培养基硬中国煤化工音养。处理3了4.4%。表明:高浓度的BA对白芨的种子萌发的植株大小与THCNMH3殖率比处理具有抑制作用，低浓度BA用量(处理1)和高4低10%，因此个丁口及墙殖时是处埋4。第6期赵漫丽，等:添加剂对白芨组培的影响表2不同碳粉用量对白芨种子萌发的影响Tab. 2 Effects of diferent Carbon dosage on Bletilla germnination萌发率/%污染率/%处理培养基.BAV碳粉/ (g.LI)geminationcontaminatreatmentculture medium(mg.L~')(mg.L~I)carbonpercentageM0.51.089.32.3399. 70.8MS98.10.32.096.21.692.4.1.9表3不同激素浓度对白芨增殖的影响Tab. 3 Effects of different hormone concentration on Bletilla proliferation苗的大小Vcm培养基琼脂/接种苗数增殖率/%BANKT/NAAVshoot sizeculture(g.L") No. of rate of(mg.L") (mg.L") (mg.L~)平均直径平均高度mediumagarose seeding proliferationaverage diameter average heightIS11800.225.52300.212.2us1.5.5103000.247.53100.22.2.5_2.52800.19在表4这一-组试验中，是在表3筛选出对于BA +1.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA +琼脂4.0g/L白芨增殖最适合激素配比的基础上，添加了不同+豌豆粉12g/L,增殖率470%。表3中的最高增用量的豌豆粉。豌豆粉具有一定凝固作用，从表殖率是处理4,增殖率310%，与表4中的处理24中可以看出，增加豌豆粉的用量，就可以减少相比，降低了160%，但处理4中的两者激素配琼脂的用量，并且两者在用量上有一定的配比关比是3:1，比表3中的低。表明:加人豌豆粉后,系，4g/L豌豆粉的凝固性相当于1 g/L琼脂。在利于提高白芨增殖率，降低琼脂的用量，植株长本组试验中，增殖率最高的是: MS + 1.5 mg/L势较表3中每--处理都相应健壮。表4不同用豌豆粉对白芨增殖的影响Tab. 4 Effects of diferent Pease dosage on Bletilla proliferation处理培养基豌豆/接种苗数 增殖率/%BA/treat- culture(mg.L") (ng.L-") (mg.L")(g.L") (mg.L~) No. ofrateof平均直径 平均高度peaseseeding proliferation averageaveragediameter height2200212. 116l03400.253.2122.40. 25中国煤化工fYHCNMHG824云南农业大学学报第26卷表5是不同用量的魔芋粉对白芨增殖影响，脂4.0g/L+魔芋粉15 g/L增殖率540%;表5与表4是平行试验。魔芋粉与琼脂的用量配比是中，最高增殖率植物生长调节剂的浓度与表3中5:1，最好的用量是4.0g/L琼脂+15g/L魔芋粉,的相同，但最高增殖率提高了230%，与表4相这时培养基的硬度刚好适合白芨增殖苗培养，既比最高增值率提高了70%，苗的长势都比表3, 4能使培养基中的营养成分发挥作用，也能支持好的好。表明:加入魔芋粉有利于白芨增殖率的提植株生长。此组试验中最好增殖配方为: MS +高和植株的健壮生长，并且增殖率高于加入豌豆2. 0mg/L BA +2.0mg/L KT +0.5 mg/L NAA +琼粉的增殖培养。表5不同用量 的魔芋粉对白芨增殖的影响Tab. 5 Effects of diferent konjac glucomannan dosage on Bletila proliferation苗的大小Vcm豌魔芋粉/处理培养基A琼脂/(g.[)接种苗数增殖率/% .shoot sizetreat-culture(g.L"')No. ofrateof平均直径 平均高度(mg.L") (mg.L"') (mg.L~)konjacmentmediumagaroseseeding proliferation averageaverageglucomannandiameter_ heightMS0.5225103800.213.21.004200.233.11.5154400.222.0400.24IS2.563700. 193.3表6是不同用量的小麦粉对白芨增殖的影响，+0.5 mg/L NAA +琼脂5.0g/L+小麦粉9 g/L,此组试验也是添加剂影响白芨增殖平行试验。小增殖率380%，激素配比与对照试验(表3)和麦粉与琼脂的用量配比是4.5:1,从表中可以看平行试验(表5)的相同。增殖率与表5相比，出，小麦粉具有凝固作用，加人小麦粉，可以减每- -处理的都有所下降，并且苗的长势弱，但略少琼脂的用量。从处理1 ~4增殖率呈上升趋势,好于对照试验(表3)。表明:加人不同用量小麦但到处理5增殖率下降。在表6中增殖试验中最粉，对白芨增殖有效果，但效果没有加人豌豆粉好的增殖配方为MS +2. 0 mg/L BA +2. 0 mg/L KT和魔芋粉的好。表6不同用量的小麦粉对白 芨增殖的影响Tab. 6 Effects of different Wheat dosage on Bletilla proliferation苗的大小/cm .处理培养基小麦/接种苗数增殖率/%BAVT/NAAtreat- culture(mg.L") (mg.L") (mg.L")(g.L-') (mg.L") No. ofrate of~平均直径 平均高度wheatdiameter height1‘0.522. 5900. 182.68o. 1913.5700.202.3200.19.2.4表7是不同用量的马铃薯粉对白芨增殖的影呈上升趋势中国煤化工势;从处理响，马铃薯粉与琼脂粉的用量配比是: 5.5:1,3~4呈上升HCN M H G明增殖趋势同样的马铃薯粉也具有凝固作用。从处理1 ~2不稳定。表7中最好的增殖配方为MS +第6期赵漫丽，等:添加剂对白芨组培的影响8251.0 mg/L BA +1.0mg/L KT +0.5 mg/L NAA +一处理的增殖率与对照(表3)比较效果均不琼脂3.0g/L +马铃薯粉22.0g/L,增殖率好。对增殖平行培养的4组数据进行比较，增320%。数据显示，这组中最高的增殖率配方殖效果最好的是添加魔芋粉，其次是:豌豆粉,中，所需要的植物生长调节剂的用量较低，每小麦粉，马铃薯粉(表3~7)。表7不同用的马铃薯粉对白芨增殖的影响Tab. 7 Effects of different potato dosage on Bletilla proliferation苗的大小/cm处理培养基BAVKT/NAA琼脂/马铃薯/接种苗数 增殖率/%shoot sizetreat-culture(g.L"l) (g.L") No. ofrateof平均直径 平均高度(mg.L") (mg.L") (mg.Ll)mentmediumagarosepotatoseeding proliferation average averagediameter height1S0.5227. 5200. 172.2IS1.03100. 162. 31.5.516.5700.211. 92.01300.161.8AS.2.565.5900.151.72.3不同培 养基对生根的影响的基础上，加人不同用量香蕉泥以后，白芨的平表8是不同激素组合对白芨生根的影响，以均根数，平均根长，平均根粗都比(表8)同一1/2MS为基本培养基，在0.5mg/L BA水平上，激素浓度配比效果好。从表9中可以得出，最适.设计了5个处理，NAA 和IBA浓度用量相等，浓合白芨生根的培养配方是: 1/2 MS +0.5 mg/L BA .度梯度是0.5 mg/L。从表8中可以看出,加人植+1.0mg/LNAA+1.0mg/LIBA+70g/L香蕉泥。物激素白芨的生根率为100%。生根效果最好的处理4和处理5中香蕉泥的用量高于80g/L,其是处理3, NAA和IBA的浓度用量是1.5 mg/L生平均根数及其平均根长和平均跟粗都呈下降趋势,长激素类:细胞分裂素=6:1,表明:生长激素类表明:如果香蕉泥用量过多,不利于白芨生根。.浓度高于细胞分裂素，有利于白芨生根，并且植通过比较表8和表9,说明加人香蕉泥有利于白株比较健壮。芨生根，并且苗长得比较健壮，能提高白芨在室表9是在表8筛选出适合白芨生根激素配比外炼苗的成活率。表8不同激素组合对白芨生根影响Tab.8 Efects of different hormone concentration on Bletilla rootage处理培养基生根率/%平均根长/cm平均根粗/emBA/IBA平均根数/条rate ofaverage root average root(mg.L"') (mg.L") (mg.L~)rootageaverage rootslengthdiameter1/2MS1003. 32.020.08.05.13.220.137.35. 154.50.1952.5中国煤化工0. 09YHCNMHG826云南农业大学学报第26卷表9不同用量的香蕉泥对白 芨生根影响Tab. 9 Effects of diferent Banana dosage on Bleila rootage处理培养基香蕉泥/生根率/%平均根平均根 长/cm平均根粗cmBA/NAAIBAVtreat- culturerate ofaverage root average rootment medium(mg.L) (mg.L") (mg.L")bananarootage_ average roots lengthdiameter11/2MS0. 50.56006.93. 200.1.51.077.66.620. 291.51.8(9.45.210.182.0906.83.950.171/2MS .2.51005.63.170.092.4白芨组培苗炼苗加剂不仅起到凝固作用，还抑制褐化、为白芨增成苗培养后的白芨出瓶前，将白芨试管苗转殖提供营养物质。其中加入魔芋粉增殖效果较其移到适当遮阳的自然光下炼苗- -段时间，使根系他四组好。白芨工厂化生产中，利用添加魔芋粉发达粗壮，以增强幼苗对环境的适应力。然后在有利于白芨的继代增殖培养，有利于提高经济效生长健壮的试管苗从瓶中取出，小心地将根部附益，但魔芋粉在白芨增殖过程中具体的作用机理着的培养基洗净，并用0. 1% ~0. 2%高锰酸钾溶还需要进一步研究。液浸泡2~3 min,然后捞起，待植株表面水分稍(3)白芨组培苗的炼苗移栽成活率是建立白凉干时即可种植。栽植白芨组培苗的基质配比是芨离体快繁的关键4。在白芨炼苗过程中，深山苔藓:珍珠岩:腐殖土配比为1:1:2 (体积比)，基经腐化的腐殖土能满足瓶苗移裁后的初期营养需质经高压灭菌后放冷使用。小苗移栽好后应浇透求[“5)，珍珠岩可增加透气性['6),同时还起固定水放入温室里，温度应保持在20 ~24C，湿度保根系的作用，表面覆盖苔藓利于植株保水，保持在70%~80%，初期需要弱光照，以后可逐渐肥°7]。一般情况下，从瓶内移出的幼苗初期特别加强，直到接近自然光照，移栽成活率达90%脆弱，必须提供-一个较好的生长环境8]。炼苗期以上。间用1/2MS配置成0.1%营养液进行叶面施肥[9)，以促进植株健壮生长。自然环境对其影响3讨论较大，昆明气候较好，但在冬天昼夜温差很(1)白芨种子萌发时，NAA的用量稍微高于大['0，不利于白芨炼苗，要达到周年工厂化生产BA利于种子萌发。碳粉在白芨种子萌发中，主白芨，就应该为白芨的炼苗提供较适宜的生长环要起到吸附释放出来的有害物质和净化白芨生长境， 从温度、湿度、土温、虫害、营养等多方面微环境的作用，并且碳粉可以抑制萌发过程的褐来控制。化['。试验结果也表明，在白芨的萌发过程中，[参考文献]加入碳粉利于提高萌发率，降低污染率。(2)白芨的继代培养是实现白芨工厂化生产[1]刘蓬芹，夏丽娅中药白芨的现状研究概述[J].的重要阶段9，在白芨的组织培养过程中，用量山东医药工业，2000, 19 (5): 32.较大的是琼脂[10]。琼脂在植物组织培养中，主要[2]余朝秀，李枝林，王玉英野生白芨组培快繁技术起到凝固作用，支持植物在培养基中能较好的生研究[J].西南农业大学学报:自然科学版，2005,27 (5): 601 -604.长“"。但琼脂的市场价较高，不利于经济效益的[3]付志惠，张建霞，李洪林，等.白及种子萌发与快提高([1]。在白芨增殖对比试验中加人不同用量的速繁殖技术的研究[J]武汉植物学研究，2006,豌豆粉，魔芋粉，小麦粉，马铃薯粉,主要是因24 (1): 80-82.为它们自身具有凝固作用，可以和琼脂- -样起到[4]罗文秀,中国煤化工:快速繁殖的研凝固作用(13]，在白芨大规模生产中可以减少琼脂究概况DHC NMHG (11): 36.的用量，达到降低生产成本目的，并且这四种添[5]彭丽丽，刘祥东，刘华，等白芨的组培快繁[J]..第6期赵漫丽，等:添加剂对白芨组培的影响827中国野生植物资源，2004, 23 (5): 65.1992, 2: 26-29.[6]袁宁,何俊蓉，何锐，等.白芨组培快繁育苗技术[14] 汪计珠.白芨的组织培养[J]. 植物生理学通讯，研究[J].西南农业科技, 2009, 22 (3): 7811982 (2): 37.- 784.[15] 赫会军,陈美霞，巨荣峰，等.半夏组培苗炼苗技[7]孔长生，韩见字，龙祥友，等.小白芨的组织培养术研究[J].安徽农业科学, 2008, 36 (5): 1918与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2004, 40- 1919.(4): 453.[16]孔令义.中药创新研究与高新技术应用[M]. 北[8]谭文澄,戴策刚.观赏植物组织培养技术[M].北京:中国医药科技出版社, 2004: 178.京:中国林业出版社，1991.[17]秦廷豪.大花惠兰组培苗假植及基质配方[J].亚[9] 朱玉球，王雪根.黄花白芨组培快繁技术[J]. 浙热带农业研究，2007, 3 (4): 297 -298.江林学院学报，1999， 16 (2): 164- 169.[18]刘洪科，文颖，钟雨微，等.基质和炼苗方法对春[10]熊丽，吴丽芳.观赏花卉的组织培养与大规模生产石斛试管苗假植的影响[J].亚热带农业研究,.[M].北京:化学工业出版社，2003.2008，4 (4): 306 -307.[11] 王家福.花卉组培培养与快繁技术[M]. 北京:[19]曹善东.草莓脱毒试管苗炼苗及移栽技术研兖中国林业出版社, 2006.[J].安徽农业科学，2006, 34 (1): 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