天花粉蛋白的定点突变及聚乙二醇修饰

中国生物制品学杂志2000年3月第21卷第3期CainJ Boloical March 20080 Vo1.21 No.3中国图书分类号Q278文献标识码A文章编号 04-5505(2008)03-019404[基础研究]夭花粉蛋白的定点突变及聚乙二醇修饰安群星'雷迎峰2 穆士杰!张献清' 陈蕤'夏爱军|陈晨易静'吴原茹'徐志凯2[摘要}目的对天花粉蛋 白(Tnichourhin, TCS)进行定点突变及聚乙二酶(PBC)修饰并对修饰产物进行DNA酶活性分析。方法选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点(7F81-83和KI73-14)进行定点突变,将所构建的两个突变体(TSre.8B.cs和TCSxu3-40c)在大肠杆菌中表达,并纯化表达产物。通过第82位和173位引人的半胱氨酸残基,分别对突变体蛋白进行PBCG定点修饰。通过与突变型TCS比较,分析两个PEC修饰型TCS的DNA酶活性。结果突变的 Tcs经酶切鉴定及测序分析,证明质粒构建正确,表达的目的蛋白相对分子质量约为3000,经PEC修饰后,相对分子质量约为4000初步分析显示,与突变型TCS相比.所构建的两个PBG修饰型TCs也显示出类似DNA酶活性。结论成功进行了 Tcs的定点突变及PEG修饰,为基因工程及化学修饰方法改造TCS提供了一条可行的途径。[关键词]天花粉蛋白;定点突变;聚乙二醇;修饰Sitedirected Mutation of Trichosanthin and Chemical Modification of Mutant byPolyethylene GlycolAN Qun-xing,LEI Ying feng, MU Shi-ji, et al (Department of Blood Transfision , Xjing Hospital, Fouth Military Meldi-cal University ,Xi’an 710032, China )[Abstract] Objective To induce site dircted mutation o rchosanthin (TCS),modif tbe mutant by plytylene gycol (PEG) andanalyze is DNaelike actvity .Methods Two potential anigenic deleminants of TCS, YFF81-83 and KR173- 174, were selected by computermodeling, based on which the genes encoding two site directed mutants of TCS, TCSrmu.BAss and TS731706,，were amplifed by PCR, insert-ed into pRSET-A vetor and tansfomed to E. coli DHSa. The recombinant plasmid was extracted, denified by retriction analysis and se-quencing and tansfomed to E. coli BL21(DE3) for expesion under induction of IPTC. The expresed product was identif.ed by SDS-PACEand Westem blot and modified by PEG. The DNase like acivitis of the two PEG modified mutants were analyed and compared wih thoee ofunmodifed mutants . Resuts Both rstriction analysis and sequencing result showed that reombinant plesmnids were; constructed crectly.Therelative molecular mases of the expressed products before and afer moificationo were about 30 000 and about 40 000 repetively. like unmod-ified TCS mutant,he two mutants modified by PEC showed DNase -ike aciviy. Conclusion The stedieted mutation of TcS was succefully induced, and the mutants were mdifed by PEC. It provided a feasible appach for reonstueting TCS by gene enineering and chemicalmoification.[Key words] Ticoanhin;Site dieeted mutin;olyethylene eycol; Mifcetion天花粉蛋白(Tichoanthin , TCS)是中草药天花粉基(TC8.8BAcs的82位和TSK13170c的173位),对的有效成分,属于I型核糖体失活蛋白(Ribosome-inac-其进行聚乙二醇定点修饰(Site-directed PECylation)。tivating proteins, RIPs) ,具有抗病毒、抗肿瘤引产及免经初步检测，修饰产物仍具有类似DNA酶活性。该疫调:节等多种药理活性,特别是其抗人类免疫缺陷病研究为基因工程及化学修饰方法改造TCS提供了- -毒(Humen immunodeficiency vins, HV)活性更引起世条可行的途径,值得进-步探索研究。界关注。然而,TCS强烈的免疫原性和较为短暂的血浆半衰期阻碍了其进- -步 的临床应用。本研究针对1.材料与方法.TCS分子上可能的抗原决定簇位点(YFF81-83和1.1菌株及质粒KR173-174)进行定点突变,并通过引人的半胱氨酸残E. coli DH5a和BL21 (DE3)为第四军医大学微基金项目:陕西省科技计划项目(2003K10C9);西京医院学科助生物学教研室保存;质粒pRSET-A和pUC19由该室推计划项目(XIZT07M09).张海博I中国煤化工作者单位:1第四军医大学西京医院输血科(西安710032);2第1.2四军医大学微生物学教研室(西安70033)."THCNMH G植w空四出延取试间益则日北京鼎国生物技术通讯作者:徐志凯, E mail: zikaixu@ fmm. edu.cn中国生物制品学杂志2008年3月第21卷第3期Chin J Biogcals March 2008, Vval.21 No.3公司;胶回收试剂盒购自宝信公司;质粒快速提取试2.结果剂盒购自Promega公司;Ni-NTA纯化试剂盒购自In-2.1 TCS 的定点突变、克隆与鉴定vitrogen公司;Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶以及借助计算机预测, YFF81-83和KR173-174被确限制性内切酶BamHI和EcoR I均购自TaKaRa公定为TCS分子上可能的抗原决定簇位点。以栝楼司;PEG- maleimide (mPECsk)购自FLUKA公司。基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增,得到.3 TCS的定点突变、克隆与鉴定突变体TS81.8ACs和TSK173170C0基因,大小约为按照文献[1,2]方法，以栝楼基因组DNA为模750 bp(图略)。随后将其克隆至pRSET-A载体,转板,分别采用超长引物PCR和重叠引物延伸PCR法化感受态E. coli DHSa, 提取质粒进行酶切鉴定,结扩增TCS突变体(TSr:B5和TRS173170)基果与预期相符,见图1。将筛选的阳性克隆测序,在因。随后将其克隆至pRSET-A载体,转化感受态人为突变位点以外均未见其他突变发生。E.coliDH5a,用碱裂解法提取质粒,进行酶切鉴定及测序。bu1.4 TCS 突变体的表达与鉴定将鉴定正确的重组质粒转化E.coli BI212000(DE3) ,挑取阳性克隆,接种于IB培养液中(含Amp100100 prg/ml) ,37C振摇培养过夜。次日按1%比例转500250接后,37C振摇培养2.5 h,当A0达到0.5-0.6时，加入IPTC至终浓度为0.1 mmol/L, 37C诱导培养5~6 h,离心收集菌体并进行12% SDS-PAGE鉴定。随后将蛋白转移至NC膜上,以抗天然TCS兔血清1:DNA marker D202:TSms-ms;3:TCSsers.noc.(第四军医大学微生物学教研室制备)为一抗, 鼠抗图1重组质粒的酶切鉴定Fg 1. Restriction map of recombinant plasmids兔IgG-HRP(购自宝信公司)为二抗,进行Westem2.2 TCS 突变体的表达与鉴定blot鉴定,用ECL显色后观察结果。将鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL211.5 TCS 突变体蛋自的纯化所构建的工程菌经培养和IPTG诱导,离心收集(DE3),经IPTG诱导培养后收集菌体,进行SDS-菌体,加入裂解缓冲液,并进行超声碎菌,收集上清PAGE分析。结果在相对分子质量约30000处出现进行纯化。具体纯化操作参照Invitrogen公司的Ni-明显条带,见图2,与预期的6His-TCS融合蛋白大小.一致。经Westemblot鉴定,结果在相应位置出现了NTA纯化试剂说明书进行。表达蛋白的特异性条带,见图3。1.6 TCS 突变体蛋白的PEG定点修饰将纯化后的突变体蛋白与mPECsk在PBS缓冲Mr 12液中按1:10摩尔比混合,于25C反应8h。用20倍97 000体积的Buffer A(含20 mmol/L Tris-HCl, 1 mmo/L66000EDTA,pH7.5)稀释反应混合物,终止反应。将反应53000产物上样于预先用Buffer A平衡的CM-Sepharose36000 -CL-6B( Pharmnacia)柱内,以含0~0.2 mol/L NaCl的BuferA线性梯度洗脱,收集样品,进行12% SDS-24 000PAGE鉴定。.1.7 DNA酶活性测定1:protein mark在20 μ反应体系内(包含50 mmol/L Tis-HCl,6:negative10 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L CaC2, 100 mmol/L NaCl,图2表达产物的SDSPAGE分析Fg 2. SDS-PAGE profile of expressed productpH 8.0) ,分别加人不同类型的TCS 2 ug,然后加入中国煤化工1隅超螺旋质粒pUC19,室温反应1 h。将各反应产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳,观察超螺旋质粒是否:MHCNMHG析,结果在相对被切割为开环及线性DNA。.分子质量约30 000处出现单一蛋白条带,见图4。中国生物制品学杂志2008年3月第21卷第3期Chin J Bioloicals March 2008, Vol.21 No.2.4 TCS 突变体的PEG定点修饰3.讨论两个突变体经PEG修饰后,相对分子质量明显TCS是中草药天花粉的有效成分,人药已有增大,约40 000,高于PEGs与TCS之和,见图4。推2000多年历史,传统中医主要将其应用于中期妊娠测可能是由于线状PEC分子伸展在蛋白表面,使其引产以及胎物残留、异位妊娠和葡萄胎等妇科疾病泳动速率降低;另-方面可能是由于PEG的水化程的治疗。近年来,随着人们对TCS结构和功能的深度非常高,使得PEC化蛋白的泳动行为反常。人研究,发现它属于I型RIPs,具有多种生物活性和药理特性。其生物活性主要包括:具有RNA N-糖苷酶活性,可以裂解核糖体28S rRNA上第4 324位腺嘌呤碱基与核糖之间的N-糖苷键,从而使真核细胞1.2:TS8183ACs;3,4:TCS17-14Cc.核糖体失活[3];具有类似DNA酶活性,可以切割超图3表达产物的Westem blot分析螺旋DNA,产生开环和线性DNA[4);新近研究表明,Fig 3. Western bottig of expressed productTCS还可诱导细胞凋亡、增强趋化因子作用等[5.6。MIr_7当然,最被人们看好的还是其药理活性。它可抑制97 400某些肿瘤的生长,对乙型肝炎病毒、麻疹病毒以及单66 20043 000纯疱疹病毒等均有显著抑制作用,其较强的抗-HIV活性更引起人们广泛关注。1989 年, McGrath等[7]31 000首次报道了TCS(商品名为GLQ223)在体外能选择性地抑制急性感染的淋巴细胞和慢性感染的巨噬细胞内HIV-1的复制,有些方面甚至优于美国FDA批14 400准的第一个AIDS临床用药AZT,引起世界关注。因此,TCS在临床特别是AIDS治疗方面具有潜在的应1:protein marker;2,3: TCSrmu . sas;4, 5: TCSuours- moc;用价值。6:PDG-TCSmx- acs;7:PEG-TCSr3- noc.然而,TCS在临床观察及应用中也存在一些问图4修饰后TCS的SDS-PAGE分析题,其中最主要的就是其强烈的免疫原性和短暂的Fig 4. SDS.PAGE profile of mdifed TCS血浆半衰期,这也是TCS至今未能成为治疗AIDS临2.5 DNA 酶活性测定.床用药的根本原因。作为人体的一种异己蛋白，将超螺旋质粒pUC19分别与各型TCS在一定TCS具有很强的免疫原性,在临床观察中会产生一条件下孵育后,行琼脂糖凝胶电泳,结果与突变型些如过敏反应、神经和肾脏毒性等副作用。据报道，TCS--样,两个PEG修饰型TCS也显示出类似DNA体内注射TCS会产生破坏性IgG和IgE抗体,反复酶活性,见图5。注射可导致严重的过敏反应甚至死亡(8。此外,在Tcs的动物试验及人体观察中,也遇到过如肌痛、发烧、肾毒性及神经毒性等副反应。TCS作为一种相对分子质量不到27 000的蛋白质,在体内的半衰期..二相对短暂,注人机体后,会很快被肾小球过滤,丢失s在尿液中。加之反复注射会产生抗体的破坏作用以及血液内蛋白酶的降解作用,其在体内半衰期只有8.4~ 12.7 min。要达到其在体内的有效治疗浓度,必须大剂量反复注射。1:pUC19 control;2: pUC19 + TCSr1- BACs;3: pUC19 +只有设法降低TCS可能引起的毒副反应，延长TCSxau73- 140c;4: pUC19 + PEGTSr81- BAcs; 5: pUC19 +其在体内的半衰期,同时保持其活性不受或少受影PEG-TCSxu73- I740G;Ne:nicked dircular DNA;L: linear DNA; .响,T中国煤化王价值的AIDS临床S:superoiled DNA.图5 TCS突变体及PEG修饰体的DNA酶活性分析用药泼展给改造蛋白多Fg 5. DNase like activities of TCS mutant betore and at-肽类TH.CNMH .生物学软件分析，ter modifncation(下转第203页)中国生物制品学杂志2008年3月第21卷第3期Chin J Biolgcale March 2008, Vol.21 No.3203泛使用。工程菌全细胞乳糖诱导培养物抗原对攻毒g声gangrene. Vocie, 193,11 (12):1253-1258.小鼠的保护率有所提高。[4]Hunter sE, Bromn JE,0yston PC,et al.Cand BE. Molecular ganetic anal-yais of bete loxin of Cloridiun perfringers reveals sequence homoloey本实验结果表明,含C型产气荚膜梭菌a-Br-Bwith alpha-loxin, gum me-toxin, and leukocidin of Stpbhyoou sureu .融合蛋白的重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能Infct Inmumn, 193,61(9):3958-3965.够有效刺激免疫ICR小鼠产生特异性抗体,从而达[S]Sakurai J, Fuyli Y. Puification and dancteizaion d Cotridiun prn-到保护的目的,具有较强的免疫原性,可以作为研制fringens beta-loxin. Toricon, 1987 ,25(12):1301-1310.预防产气荚膜梭菌所引起疾病的理想基因工程候选[6]seinhonodotir VFidrikeloti V . Site directed nutagenesis o costidiumpernfringens betatoxin epression of wild-ype and mulan toxins in bacil-菌株。lusulriti, 198, I5(8):17-23.[7]Cibet M,olive- Reynad CPoput MR,et al. Beta2 loxin, a novel toxin参考文献produced by Closridiun prfingan .Gene, 1997 ,20(3) :65-73.[1] Tball R, Feam AM, Wllianmon ED. Biochemnical and inmunloial[8]韩学波。许崇波，曾瑾,等.产气荚膜校菌aR-B融合基因的构建propertienof the C-ler minal domain o the alpha toxind Clotridum pr-及表达.中国生物制品学杂志,200,0 19(5):454-456.fringeus. . FEMS Micobiol Let, 1993,1(10)45-50.[9]王玉炯,许崇波,冯书章，等.C型产气荚膜梭菌β毒素基因克隆[2] Tiball RW,Rubidge T. The role o hieidine reidues in the alpha toxin和核苷酸序列分析中国兽医学报, 198,1(6):541 ~54s.of Catidiun pefingers .FEMS Micbiod Lit, 190,682):261-266.[3] Wllianmon ED, Ttball RW.A gnticallyy enginered vacine agint the(收藊日期20708-20)apha- toxin of Cotridiumn perfringers prodects mice aginet eperimental(上接第19页)可预测蛋白多肽类分子，上可能的抗原决定簇位点，并可通过多种方法对其抗原性较强的位点进行突变,以降低其免疫原性,减少体内副反应。对于诸如[1]安群星,穆士杰,张献清,等.天花粉蛋白突变体的构建及其在原体内半衰期短等问题,可通过采用多种药物传递技核系统中的表达.医学研究生学报.2007 ,20(4):357 ~ 359.术来提高蛋白多肽类药物的体内疗效,这其中最为[2]安群星，穆士杰，张献清，等.天花粉蛋白突变体Tcs.(KR173-174CG)的构建表达与纯化.中国生物制晶学杂志, 2006,0 19(6);成功的当数PEG修饰技术。目前已有多种不同的57 ~ ss9.PEG分子可供选择,也有多种不同的PEG修饰方法[3] Zhang JS,Liu wY. The mecharien of scion of ricoeanhin on eukaryo.可供利用。其中, PEG定点修饰法,特别是巯基修饰ic rbwsomess RNA N-gyomidase acivity of the crtotoxin. Nucleie Acds法最为常用。通过PEG修饰,蛋白多肽类药物可降Ree, 192,20(6):1271-1275.[4] Li MX, Yeung HW, Pan LP, e al. Tichoenhin,a potent HV-1 in低免疫原性、改善药动学性质、降低体内毒性以及增hibitor, can cleave speroiled DNA in vitro. Nucleie Aeids Res, 1991,19加药物稳定性等。(22):6309- 6312.本研究借助计算机预测,定位了TCS分子上可[s] Wang YY,Oyang DY,Huang H. Erhanced eptotice action of richosan能的抗原决定簇位点,即YFF81-83和KR173-174;利thin in HIV-1 infed cll. Biochem Bigphys Res Cmnn,2005,331用重组PCR技术,获得了两个突变型TCS基因，即(4):1075-1080.TSr81-8ACs和TCSkI714cc;通过基因工程技术,实[6] Li F,Mei Y,Wang,Y.Tichocanhin ihits antigo- peie T cell此pansion through nitic oxide -mdiated apoptosis pauthway. Cell Immunol,现了目的蛋白在原核系统内的可溶性表达,并通过2005,234(1):23-30.Ni-NTA亲和层析柱进行了纯化;应用PEG定点修饰技术，分别在两个突变体第82位和173位引人的半mn inmundeliciency virus rpliacion in acutely and choicallyl infeted cells of lympbogpe and mononuclear phagoeyte lineage. Proe Naul A-胱氨酸残基上共价连接了一个PEG,增加了其分子cad Sci USA, 1989 ,86(8):2844-2848.体积;DNA酶活性分析显示，与突变型TCS一样,所[8] Cai x, Ya C, Xu C,a al. lenificatin d the anino scid reidue in构建的两个PEC修饰型TCS也显示出类似DNA酶Biophys Res Commm,活性。该研究为基因工程及化学修饰方法改造TCS中国煤化工提供了一条可行的途径,值得进- - 步探索研究。TYHCNMHG(收稿日期200708-.6)